作者enicole (中智˙禪˙生活)
看板Biotech
標題[求救] real time PCR
時間Thu Dec 30 22:52:57 2010
我的樣本是動物初代培養細胞，之前先用trizol刮下來，放在-80保存
使用qiagen及DNase I獲得RNA，也有使用nano drop及跑膠確認品質
最近開始作real time PCR，使用的是biorad iQ5
要買sybr green 時，sales跟我說最近有出新的染劑evagreen，也是biorad原廠的
但是這個東西老闆以前沒有用過，所以保持懷疑的態度
要我自己去試試看好不好用
想請問各位前輩有沒有人用過這個東西，如果我要測試好不好用
1.評估的基準是甚麼?目前想到的只有測試efficiency
另外，primer的部分主要是跟著已發表的文章設計，可是發現部分跑出來的很不漂亮
目前有發現會有兩條band，或是根本跑不出band
現在還有一個不知道如何解釋的結果
2.在melting curve的波峰處有一個小小的M字型，大約是整個波的十分之一尖端處
這樣也算有兩個產物嗎?跑膠結果是只有看到一條band
3.melting curve peak溫度有很重要嗎?我的差不多一半在70幾度
4.想要使用96孔盤跑，但是有學姐說使用原廠膠膜會有收縮現象，所以周圍的孔會露出來
不知道大家有沒有這種狀況，是不是有推薦哪一家可以使用呢?
以上問題煩請各位前輩不論賜教，感恩!!
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中文名：嘉蘭
學名：Gloriosa rothschildiana O'Brien
科名：Liliaceae 百合科
別名：嘉蘭百合、火焰百合、印度百合
有毒部位：全株有毒，塊根尖端毒性最強。
中毒病狀：誤食後引起唇、舌、咽喉刺痛，接著麻木、腹部灼痛，
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 111.249.181.183
1F：推 mattmatt:1.兩者放相同量的DNA下去各別的kit內 按照建議設定 12/31 04:16
2F：→ mattmatt:比較cp 沒差很多的話就沒甚麼問題 相對定量的話影響不大 12/31 04:17
3F：→ mattmatt:2.目測同樣大小的band很難說是相同序列 序列的不同也會讓 12/31 04:20
4F：→ mattmatt:Tm值有差..有可能P到base差幾個的片段 single copy gene? 12/31 04:22
5F：→ mattmatt:有沒有不同alle的可能? 或者用3%的agarose去試著跑開看看 12/31 04:24
6F：→ mattmatt:3.端看你的產物大小和GC% 沒有絕對值 peak溫度越集中越好 12/31 04:26
7F：→ mattmatt:4.膠膜問題多多,表面多少不太平整 還是tube比較穩定一點 12/31 04:28
8F：推 mzac1b:狠一點 可以叫生技公司 完全示範一次給你看才買 12/31 13:25
9F：推 adara:試過Evagreen, 比原來的SYBR green 之靈敏度還高 01/04 20:50
10F：→ winonaforeve:理論上EVA GREEN是saturate dye所以會比SYBR的訊號強 02/04 11:48
11F：→ winonaforeve:而且也應該會更靈敏沒錯 02/04 11:48