作者enicole (中智˙禅˙生活)
看板Biotech
标题[求救] real time PCR
时间Thu Dec 30 22:52:57 2010
我的样本是动物初代培养细胞，之前先用trizol刮下来，放在-80保存
使用qiagen及DNase I获得RNA，也有使用nano drop及跑胶确认品质
最近开始作real time PCR，使用的是biorad iQ5
要买sybr green 时，sales跟我说最近有出新的染剂evagreen，也是biorad原厂的
但是这个东西老板以前没有用过，所以保持怀疑的态度
要我自己去试试看好不好用
想请问各位前辈有没有人用过这个东西，如果我要测试好不好用
1.评估的基准是甚麽?目前想到的只有测试efficiency
另外，primer的部分主要是跟着已发表的文章设计，可是发现部分跑出来的很不漂亮
目前有发现会有两条band，或是根本跑不出band
现在还有一个不知道如何解释的结果
2.在melting curve的波峰处有一个小小的M字型，大约是整个波的十分之一尖端处
这样也算有两个产物吗?跑胶结果是只有看到一条band
3.melting curve peak温度有很重要吗?我的差不多一半在70几度
4.想要使用96孔盘跑，但是有学姐说使用原厂胶膜会有收缩现象，所以周围的孔会露出来
不知道大家有没有这种状况，是不是有推荐哪一家可以使用呢?
以上问题烦请各位前辈不论赐教，感恩!!
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中文名：嘉兰
学名：Gloriosa rothschildiana O'Brien
科名：Liliaceae 百合科
别名：嘉兰百合、火焰百合、印度百合
有毒部位：全株有毒，块根尖端毒性最强。
中毒病状：误食後引起唇、舌、咽喉刺痛，接着麻木、腹部灼痛，
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 111.249.181.183
1F：推 mattmatt:1.两者放相同量的DNA下去各别的kit内 按照建议设定 12/31 04:16
2F：→ mattmatt:比较cp 没差很多的话就没甚麽问题 相对定量的话影响不大 12/31 04:17
3F：→ mattmatt:2.目测同样大小的band很难说是相同序列 序列的不同也会让 12/31 04:20
4F：→ mattmatt:Tm值有差..有可能P到base差几个的片段 single copy gene? 12/31 04:22
5F：→ mattmatt:有没有不同alle的可能? 或者用3%的agarose去试着跑开看看 12/31 04:24
6F：→ mattmatt:3.端看你的产物大小和GC% 没有绝对值 peak温度越集中越好 12/31 04:26
7F：→ mattmatt:4.胶膜问题多多,表面多少不太平整 还是tube比较稳定一点 12/31 04:28
8F：推 mzac1b:狠一点 可以叫生技公司 完全示范一次给你看才买 12/31 13:25
9F：推 adara:试过Evagreen, 比原来的SYBR green 之灵敏度还高 01/04 20:50
10F：→ winonaforeve:理论上EVA GREEN是saturate dye所以会比SYBR的讯号强 02/04 11:48
11F：→ winonaforeve:而且也应该会更灵敏没错 02/04 11:48