作者ennnnno (小玲)
看板Biotech
標題[求救] ligation都接不起來
時間Mon Dec 27 11:12:40 2010
大家好,目前在進行ligation碰到了問題
請大家幫幫忙
我目前要接的insert是2k,而vector是8k左右
insert是從pGEMT上面切下來的
經過gel elute之後濃度約45ng,260/280為1.95
而vector濃度約55ng,260/280為1.85
試了幾個condition,
V:I= 2:4,1:4,1:6,1:8,2:5,2:7,1:5,1:7,3:3
在16度裡overnight(至少有22小時,時間太長了嗎?)
然後跟JM109做transform,放冰上30min後塗盤
可是都沒長><
然後跟學姊討論,學姊說不然做一個加LB recover的動作
所以又再試了一次
v:i=6:4,1:9,1:7
這次改用2x rapid buffer,之前都是用10x
然後這批是在4度c裡ligation兩天
做transform之前加了500ml LB(NO AMP) 37度裡1小時
之後用800rpm離一分鐘,菌有離下來
然後去掉上面400ml的LB,剩下的塗盤
只有6:4那個有長,但只有一顆><
想請問大家說,到底出了什麼問題
因為insert也是從pGEMT上切下來的
會有切不完全的問題嗎?
vector是之前實驗室接另一個基因的
再把insert基因切下來,把vector elute下來 (切位相同)
所以也是確定有切動,size一樣
因此想問問有經驗的老手,我是否還要修改哪個地方呢?謝謝~~~~
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◆ From: 140.109.55.238
1F：→ ennnnno:不好意思再補充一點,第二次做ligation,v:i=1:7,1:9的部份, 12/27 11:15
2F：→ ennnnno:insert濃度是25ng(之前用完了重新elute),另外有做positive 12/27 11:16
3F：→ ennnnno:control,所以確定不是plate的問題,謝謝~ 12/27 11:17
4F：→ qumai:濃縮DNA吧 其他看起來都沒什麼問題 competent cell是自製嗎 12/27 11:53
5F：推 FENOR:V:I用1:3，然後把除了ligase之外的東西都加好，接著用一杯 12/27 12:07
6F：→ FENOR:70度的水，把混有這些東西的eppendorf放進去(上浮船) 12/27 12:08
7F：→ FENOR:溫度降到30-40度時再拿出來離心加入ligase，ligate一小時就 12/27 12:08
8F：→ FENOR:可以拿去transform了。 12/27 12:08
F大的方法真的很有新意耶~我來試看看,接不起來真的好煩啊><
另外想請問一下F大,降到30-40度是讓溫度慢慢降?
還是說70度裡要放多久???謝謝~
加入ligase後是在幾度下做ligation呢?謝謝
9F：推 liuse:樓上這什麼怪方法 70度的水.... 12/27 12:19
10F：推 SugarSa:有些人說ligation 前提高一下溫度,效率會比較好 12/27 12:22
11F：→ SugarSa:應該是為了讓捲在一起的DNA先暫時分開 12/27 12:22
12F：→ ennnnno:competent cell是買的~ 12/27 14:45
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:47)
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:48)
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:50)
13F：推 FENOR:慢慢降 12/27 19:04
14F：→ missoul:F大的方法: 把DNA展開 並逐漸降溫讓互補股稍稍靠近 12/27 23:11
15F：→ missoul:但是我建議不要把buffer(ATP)也加溫了 怕有破壞 12/27 23:11
16F：推 mattmatt:請問V:I是體積比 重量比 還是莫耳數比? 12/27 23:19
17F：→ mattmatt:另外請問ligation total體積? 使用的切位是甚麼酵素? 12/27 23:19
不是莫耳數比耶,是指的是體積比
使用的RE是EcoRI和SpeI
vector是psin-EF2-vector,約8.5k
18F：推 leoblack:當然是莫爾數比 12/28 00:15
20F：→ Invec:進去後找到 Ligations: Molar Ratio of Insert to Vector 12/28 01:43
21F：→ Invec:然後輸入I, V的大小以及V的ng數，系統會幫你計算I的ng數 12/28 01:44
22F：→ Invec:最後再按照它建議的ng數調整體積即可 12/28 01:45
23F：→ Ianthegood:transformation有沒有出錯的地方阿? 12/28 07:02
transformation會出錯的地方是!?
我做transformation就是直接加入JM109,然後放冰上30分鐘後塗盤
之後做LB recover的動作就沒放冰上了,直接放37度一小時
難道是這部份錯!?
但之前放冰上30分鐘也是沒長..=____=
24F：推 micocat:ligase確定是好的嗎 ligase buffer不要在室溫回溫哦 12/28 15:43
25F：→ micocat:還有依你的描述transform好像沒heat shock ? 12/28 15:45
26F：→ micocat:是說commercial的不hest shock應該也可以啦 12/28 15:45
嗯我沒做heat shock的動作耶~
不要在室溫回溫?我都是拿在手上然後等他回溫耶
ligase這部份我不確定耶,但之前做pGEMT ligation時他有長
那時候篩了約50顆有
不會之後又突然壞了吧....
昨天有試了f大的方法
但還是沒長......(哭)
到底是什麼地方出問題??嗚嗚~~~~~
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/28 16:51)
27F：推 mattmatt:用體積比計算是錯誤的 要用莫耳數比 12/28 22:58
28F：→ mattmatt:按照你vector和insert的大小 V:I要1:3的話 12/28 22:58
29F：→ mattmatt:vector建議150~200ng insert大概100~150ng或更多 12/28 22:59
30F：→ mattmatt:將以"純水"回溶的純化過的vector與insert加入tube後 12/28 23:00
31F：→ mattmatt:65度五分鐘 spin down然後馬上放冰上 再加入buffer ATP 12/28 23:01
32F：→ mattmatt:與ligase, total體積不超過20ul(建議10ul) 12/28 23:02
33F：→ mattmatt:依你的切位 放在12度C以下會比較好 over night ligation 12/28 23:03
34F：→ mattmatt:ligation完後加入competent cell 混勻後冰上30~45min 12/28 23:05
35F：→ mattmatt:雖然是commercial的 還是建議做一下heat shock... 12/28 23:06
36F：→ mattmatt:42度90秒 (commercial應該30秒即可) 然後冰上5min 12/28 23:07
37F：→ mattmatt:然後加入1ml LB,37度搖晃(250rpm)培養1hr.. 12/28 23:08
38F：→ mattmatt:養完後用8000rpm離心5min 去除上層medium 留100ul LB 12/28 23:09
39F：→ mattmatt:懸浮後塗盤 (commercial的 LB可以只養30min) 12/28 23:10
好,謝謝你~我會再試看看的!!!
很謝謝大家的回應耶
你們人真好!!我要再努力看看~~~~~
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/29 10:27)
40F：推 icome:何不多花1分鐘做heat shock? 12/29 12:04
41F：→ blence:pGEMT+I是5k,你的I+V是10k,這樣的大小差異比可行性完全不對 12/29 14:16
42F：→ blence:沒用heat shock,而且10k還用JM109,要成功應該難上加難 12/29 14:18
請問大小差異比是什麼意思呢?
因為insert不也是要從pGEMT上切下來嗎??
insert:vector=1:4這種比例不好接嗎??
JM109比較難transformation嗎??
謝謝~~~~
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/29 15:46)
43F：推 yaliu:應該說10k本身就不好轉進去，再不heat shock機率更低吧 12/29 20:40
44F：→ yaliu:然後你的vector應該也是自己製備的吧，或許比起商業的效率差 12/29 20:41
45F：→ yaliu:妳可以確認看看到底是沒接成功抑或是沒轉進去 12/29 20:43
46F：→ yaliu:個人認為轉型失敗的可能性較大啦 12/29 20:43
47F：推 FENOR:你為什麼沒做heat shock???? 12/30 00:18
48F：→ FENOR:我用的ligation buffer其實在室溫下回溫也沒差 12/30 00:19
49F：→ FENOR:而且heat shock完之後要用LB medium讓菌recover 12/30 00:20
50F：→ FENOR:時間也不用太長，大概十分鐘到十五分就可。 12/30 00:20
51F：→ FENOR:heat shock 30-90秒都可以 12/30 00:21
52F：推 iceking:原po原本用的是commercial的勝任細胞,照protocol做就是不 12/30 10:05
53F：→ iceking:需要heat shock,也不需要recovery~ 這也不能怪原po 12/30 10:07
54F：推 FENOR:喔喔，因為我也沒用過這種的細胞 12/30 11:53
55F：→ dragonjaff:有做control組嗎? 試試看把vector切一刀再接回去吧 12/30 16:35
56F：→ dragonjaff:會長的話至少可以確定不是transform的問題 12/30 16:36