作者ennnnno (小玲)
看板Biotech
标题[求救] ligation都接不起来
时间Mon Dec 27 11:12:40 2010
大家好,目前在进行ligation碰到了问题
请大家帮帮忙
我目前要接的insert是2k,而vector是8k左右
insert是从pGEMT上面切下来的
经过gel elute之後浓度约45ng,260/280为1.95
而vector浓度约55ng,260/280为1.85
试了几个condition,
V:I= 2:4,1:4,1:6,1:8,2:5,2:7,1:5,1:7,3:3
在16度里overnight(至少有22小时,时间太长了吗?)
然後跟JM109做transform,放冰上30min後涂盘
可是都没长><
然後跟学姊讨论,学姊说不然做一个加LB recover的动作
所以又再试了一次
v:i=6:4,1:9,1:7
这次改用2x rapid buffer,之前都是用10x
然後这批是在4度c里ligation两天
做transform之前加了500ml LB(NO AMP) 37度里1小时
之後用800rpm离一分钟,菌有离下来
然後去掉上面400ml的LB,剩下的涂盘
只有6:4那个有长,但只有一颗><
想请问大家说,到底出了什麽问题
因为insert也是从pGEMT上切下来的
会有切不完全的问题吗?
vector是之前实验室接另一个基因的
再把insert基因切下来,把vector elute下来 (切位相同)
所以也是确定有切动,size一样
因此想问问有经验的老手,我是否还要修改哪个地方呢?谢谢~~~~
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.55.238
1F：→ ennnnno:不好意思再补充一点,第二次做ligation,v:i=1:7,1:9的部份, 12/27 11:15
2F：→ ennnnno:insert浓度是25ng(之前用完了重新elute),另外有做positive 12/27 11:16
3F：→ ennnnno:control,所以确定不是plate的问题,谢谢~ 12/27 11:17
4F：→ qumai:浓缩DNA吧 其他看起来都没什麽问题 competent cell是自制吗 12/27 11:53
5F：推 FENOR:V:I用1:3，然後把除了ligase之外的东西都加好，接着用一杯 12/27 12:07
6F：→ FENOR:70度的水，把混有这些东西的eppendorf放进去(上浮船) 12/27 12:08
7F：→ FENOR:温度降到30-40度时再拿出来离心加入ligase，ligate一小时就 12/27 12:08
8F：→ FENOR:可以拿去transform了。 12/27 12:08
F大的方法真的很有新意耶~我来试看看,接不起来真的好烦啊><
另外想请问一下F大,降到30-40度是让温度慢慢降?
还是说70度里要放多久???谢谢~
加入ligase後是在几度下做ligation呢?谢谢
9F：推 liuse:楼上这什麽怪方法 70度的水.... 12/27 12:19
10F：推 SugarSa:有些人说ligation 前提高一下温度,效率会比较好 12/27 12:22
11F：→ SugarSa:应该是为了让卷在一起的DNA先暂时分开 12/27 12:22
12F：→ ennnnno:competent cell是买的~ 12/27 14:45
※ 编辑: ennnnno 来自: 140.109.55.238 (12/27 14:47)
※ 编辑: ennnnno 来自: 140.109.55.238 (12/27 14:48)
※ 编辑: ennnnno 来自: 140.109.55.238 (12/27 14:50)
13F：推 FENOR:慢慢降 12/27 19:04
14F：→ missoul:F大的方法: 把DNA展开 并逐渐降温让互补股稍稍靠近 12/27 23:11
15F：→ missoul:但是我建议不要把buffer(ATP)也加温了 怕有破坏 12/27 23:11
16F：推 mattmatt:请问V:I是体积比 重量比 还是莫耳数比? 12/27 23:19
17F：→ mattmatt:另外请问ligation total体积? 使用的切位是甚麽酵素? 12/27 23:19
不是莫耳数比耶,是指的是体积比
使用的RE是EcoRI和SpeI
vector是psin-EF2-vector,约8.5k
18F：推 leoblack:当然是莫尔数比 12/28 00:15
20F：→ Invec:进去後找到 Ligations: Molar Ratio of Insert to Vector 12/28 01:43
21F：→ Invec:然後输入I, V的大小以及V的ng数，系统会帮你计算I的ng数 12/28 01:44
22F：→ Invec:最後再按照它建议的ng数调整体积即可 12/28 01:45
23F：→ Ianthegood:transformation有没有出错的地方阿? 12/28 07:02
transformation会出错的地方是!?
我做transformation就是直接加入JM109,然後放冰上30分钟後涂盘
之後做LB recover的动作就没放冰上了,直接放37度一小时
难道是这部份错!?
但之前放冰上30分钟也是没长..=____=
24F：推 micocat:ligase确定是好的吗 ligase buffer不要在室温回温哦 12/28 15:43
25F：→ micocat:还有依你的描述transform好像没heat shock ? 12/28 15:45
26F：→ micocat:是说commercial的不hest shock应该也可以啦 12/28 15:45
嗯我没做heat shock的动作耶~
不要在室温回温?我都是拿在手上然後等他回温耶
ligase这部份我不确定耶,但之前做pGEMT ligation时他有长
那时候筛了约50颗有
不会之後又突然坏了吧....
昨天有试了f大的方法
但还是没长......(哭)
到底是什麽地方出问题??呜呜~~~~~
※ 编辑: ennnnno 来自: 140.109.55.238 (12/28 16:51)
27F：推 mattmatt:用体积比计算是错误的 要用莫耳数比 12/28 22:58
28F：→ mattmatt:按照你vector和insert的大小 V:I要1:3的话 12/28 22:58
29F：→ mattmatt:vector建议150~200ng insert大概100~150ng或更多 12/28 22:59
30F：→ mattmatt:将以"纯水"回溶的纯化过的vector与insert加入tube後 12/28 23:00
31F：→ mattmatt:65度五分钟 spin down然後马上放冰上 再加入buffer ATP 12/28 23:01
32F：→ mattmatt:与ligase, total体积不超过20ul(建议10ul) 12/28 23:02
33F：→ mattmatt:依你的切位 放在12度C以下会比较好 over night ligation 12/28 23:03
34F：→ mattmatt:ligation完後加入competent cell 混匀後冰上30~45min 12/28 23:05
35F：→ mattmatt:虽然是commercial的 还是建议做一下heat shock... 12/28 23:06
36F：→ mattmatt:42度90秒 (commercial应该30秒即可) 然後冰上5min 12/28 23:07
37F：→ mattmatt:然後加入1ml LB,37度摇晃(250rpm)培养1hr.. 12/28 23:08
38F：→ mattmatt:养完後用8000rpm离心5min 去除上层medium 留100ul LB 12/28 23:09
39F：→ mattmatt:悬浮後涂盘 (commercial的 LB可以只养30min) 12/28 23:10
好,谢谢你~我会再试看看的!!!
很谢谢大家的回应耶
你们人真好!!我要再努力看看~~~~~
※ 编辑: ennnnno 来自: 140.109.55.238 (12/29 10:27)
40F：推 icome:何不多花1分钟做heat shock? 12/29 12:04
41F：→ blence:pGEMT+I是5k,你的I+V是10k,这样的大小差异比可行性完全不对 12/29 14:16
42F：→ blence:没用heat shock,而且10k还用JM109,要成功应该难上加难 12/29 14:18
请问大小差异比是什麽意思呢?
因为insert不也是要从pGEMT上切下来吗??
insert:vector=1:4这种比例不好接吗??
JM109比较难transformation吗??
谢谢~~~~
※ 编辑: ennnnno 来自: 140.109.55.238 (12/29 15:46)
43F：推 yaliu:应该说10k本身就不好转进去，再不heat shock机率更低吧 12/29 20:40
44F：→ yaliu:然後你的vector应该也是自己制备的吧，或许比起商业的效率差 12/29 20:41
45F：→ yaliu:你可以确认看看到底是没接成功抑或是没转进去 12/29 20:43
46F：→ yaliu:个人认为转型失败的可能性较大啦 12/29 20:43
47F：推 FENOR:你为什麽没做heat shock???? 12/30 00:18
48F：→ FENOR:我用的ligation buffer其实在室温下回温也没差 12/30 00:19
49F：→ FENOR:而且heat shock完之後要用LB medium让菌recover 12/30 00:20
50F：→ FENOR:时间也不用太长，大概十分钟到十五分就可。 12/30 00:20
51F：→ FENOR:heat shock 30-90秒都可以 12/30 00:21
52F：推 iceking:原po原本用的是commercial的胜任细胞,照protocol做就是不 12/30 10:05
53F：→ iceking:需要heat shock,也不需要recovery~ 这也不能怪原po 12/30 10:07
54F：推 FENOR:喔喔，因为我也没用过这种的细胞 12/30 11:53
55F：→ dragonjaff:有做control组吗? 试试看把vector切一刀再接回去吧 12/30 16:35
56F：→ dragonjaff:会长的话至少可以确定不是transform的问题 12/30 16:36