作者garybounce (Bounce)
看板Biotech
標題[求救] 金黃色葡萄球菌 突變株之構築
時間Thu Dec 16 17:04:00 2010
在進行金黃色葡萄球菌 staphylococcus aureus ATCC8095(分離自奶油派)
將其spa (Protein A)突變株的構築
方法是使用電穿孔
將pGEM帶有spa 上下游基因中間插入Tetracyclin抗藥性基因之plasmid
送入菌體當中，希望利用同源性互換的方式突變掉該基因
Protoacal 是參考下列paper
Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus
FEMS Microbiology Letters
Volume 94, Issue 1, Date: July 1992, Pages: 133-138
Steve Schenk, Richard A. Laddaga
S. aureus competent cell 製備步驟大概如下
O/N culture-> subculture to OD600約1~2之間 (測過生長曲線，Log phase)
將菌體離心下來後，以去離子水 wash 3次
再使用10% gllycerol 以1/10及 1/5體積 各wash一次
最後進行分裝，每管約有3~6x10^9 cfu
電菌condition:
0.1-cm gap electroporation cuvette
100 ohms resistance, 25microF, 2.3kV
SOC medium or LB 養一小時塗盤
目前情況是
Negative 都很乾淨不長，偶爾一兩顆
實驗組就是兩天的培養，會長大概10顆左右
subculture 也都還是會長
但是在PCR 確認時，都amplify是WT的size
condition 其實有微調過 DNA loading的量也調過
但是都沒有拿到Positive 的transformant
PCR check 試過了莫約10次..
蠻灰心的~~~~~
因為之後可能也要做其它基因的mutant
現在這個做不出來就令人擔心
我看PAPER在S. aureus的mutation
其他人都做得嚇嚇叫
不知道有什麼特殊因素是我不知道的嗎?
還是說其實是有strain的限制
麻煩有操作過的前輩
給盞明燈~~
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.213.79
1F：→ left873:plasmid可能要先經過Staph RN4220再放進你的菌株 12/17 09:34
2F：→ garybounce:請問先把plasmid 轉到Staphy RN strain當中的用意是? 12/17 14:13
3F：推 licat:請問其他paper也是用pGEM的質體構築突變株的嗎？ 12/17 19:56
4F：→ garybounce:不是，大部分都是使用shuttle vector 12/18 00:36
5F：→ garybounce:當初也希望使用類似的的質體，例如pOK之類的 12/18 00:38
6F：→ garybounce:但是被老闆拒絕了，他覺得沒必要... 12/18 00:39
7F：→ licat:我沒作過Staph 但是作其他細菌時都會使用suicide vector 12/19 22:02
8F：→ licat:或是temperature-sensitive shuttle vector來進行基因剔除 12/19 22:05
9F：推 licat:如果用pGEM 應該沒辦法進行後面兩次crossing-over的篩選 12/19 22:16
10F：→ garybounce:了解，請問樓上也是作Gram positive的嗎? 12/20 01:36
11F：→ garybounce:我明天再跟老闆討論看看~ 12/20 01:36
12F：→ licat:no... 我是作gram-negative bacteria的 12/20 18:36