作者garybounce (Bounce)
看板Biotech
标题[求救] 金黄色葡萄球菌 突变株之构筑
时间Thu Dec 16 17:04:00 2010
在进行金黄色葡萄球菌 staphylococcus aureus ATCC8095(分离自奶油派)
将其spa (Protein A)突变株的构筑
方法是使用电穿孔
将pGEM带有spa 上下游基因中间插入Tetracyclin抗药性基因之plasmid
送入菌体当中，希望利用同源性互换的方式突变掉该基因
Protoacal 是参考下列paper
Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus
FEMS Microbiology Letters
Volume 94, Issue 1, Date: July 1992, Pages: 133-138
Steve Schenk, Richard A. Laddaga
S. aureus competent cell 制备步骤大概如下
O/N culture-> subculture to OD600约1~2之间 (测过生长曲线，Log phase)
将菌体离心下来後，以去离子水 wash 3次
再使用10% gllycerol 以1/10及 1/5体积 各wash一次
最後进行分装，每管约有3~6x10^9 cfu
电菌condition:
0.1-cm gap electroporation cuvette
100 ohms resistance, 25microF, 2.3kV
SOC medium or LB 养一小时涂盘
目前情况是
Negative 都很乾净不长，偶尔一两颗
实验组就是两天的培养，会长大概10颗左右
subculture 也都还是会长
但是在PCR 确认时，都amplify是WT的size
condition 其实有微调过 DNA loading的量也调过
但是都没有拿到Positive 的transformant
PCR check 试过了莫约10次..
蛮灰心的~~~~~
因为之後可能也要做其它基因的mutant
现在这个做不出来就令人担心
我看PAPER在S. aureus的mutation
其他人都做得吓吓叫
不知道有什麽特殊因素是我不知道的吗?
还是说其实是有strain的限制
麻烦有操作过的前辈
给盏明灯~~
谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.213.79
1F：→ left873:plasmid可能要先经过Staph RN4220再放进你的菌株 12/17 09:34
2F：→ garybounce:请问先把plasmid 转到Staphy RN strain当中的用意是? 12/17 14:13
3F：推 licat:请问其他paper也是用pGEM的质体构筑突变株的吗？ 12/17 19:56
4F：→ garybounce:不是，大部分都是使用shuttle vector 12/18 00:36
5F：→ garybounce:当初也希望使用类似的的质体，例如pOK之类的 12/18 00:38
6F：→ garybounce:但是被老板拒绝了，他觉得没必要... 12/18 00:39
7F：→ licat:我没作过Staph 但是作其他细菌时都会使用suicide vector 12/19 22:02
8F：→ licat:或是temperature-sensitive shuttle vector来进行基因剔除 12/19 22:05
9F：推 licat:如果用pGEM 应该没办法进行後面两次crossing-over的筛选 12/19 22:16
10F：→ garybounce:了解，请问楼上也是作Gram positive的吗? 12/20 01:36
11F：→ garybounce:我明天再跟老板讨论看看~ 12/20 01:36
12F：→ licat:no... 我是作gram-negative bacteria的 12/20 18:36