作者rayya (KTR衝合歡山)
看板Biotech
標題[求救] PCR & Western & Cell culture
時間Thu Dec 16 00:07:41 2010
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----
最近小弟在養細胞也在同時做PCR和Western均有發現問題想請教高手
養細胞：培養液跟文獻上的一樣，trypsin的溫度在室溫，作用時間3分鐘。
但還是會有細胞變型的情形發生，從原本小顆的細胞變細長。
PCR：重複以前學長姐的的步驟，PRIMER和溫度和時間都沒錯，目標在大約300 bp，
但有雜band形成，微弱的兩條band出現在600、700左右的位置，會是甚麼問題呢?
Western： transfer 電流 250 mA，時間2.5小時，
但Marker只剩下最下面的band被轉過去，用CMB染已轉的膠上沒有蛋白殘留。
現在想說繼續接一抗，偵測有沒有蛋白質過去，但第一次看到這種情形。
想請問有沒有高手可以替我解答，感謝。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.44.210.167
1F：推 Ianthegood:PCR有target band出來就好了不要要求太多 橋溫度時間 12/16 11:54
2F：→ Ianthegood:離子濃度只是跟自己過不去 12/16 11:54
3F：→ Ianthegood:western不是可以丟ponceau S? 12/16 11:55
4F：→ rayya:ponceau S 我們實驗室好像沒有，請問一下大概多少呢? 12/17 02:14
5F：推 leoblack:ponceau S很便宜~且可一直reuse~泡一罐可以用很久 12/17 10:26
6F：→ Ianthegood:一次用一瓶都比你一抗便宜吧= = 12/17 19:28
7F：推 pepaduck:細胞會不會是有被黴漿菌之類的汙染了,有些試劑可以檢測 12/17 21:06
8F：→ pepaduck:PCR我會懷疑是primer不純,直接請廠商重合給你試試 12/17 21:07
9F：→ pepaduck:Western我覺得可能是沒弄緊,轉的時候蛋白都掉到buffer裡 12/17 21:08
10F：→ pepaduck:濾紙多夾兩片再做一次(我以前與過類似問題因此解決了) 12/17 21:09
11F：推 boblu:你 WB "最下面" 指的是分子量最小的？ 12/22 00:22