作者rayya (KTR冲合欢山)
看板Biotech
标题[求救] PCR & Western & Cell culture
时间Thu Dec 16 00:07:41 2010
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
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最近小弟在养细胞也在同时做PCR和Western均有发现问题想请教高手
养细胞：培养液跟文献上的一样，trypsin的温度在室温，作用时间3分钟。
但还是会有细胞变型的情形发生，从原本小颗的细胞变细长。
PCR：重复以前学长姐的的步骤，PRIMER和温度和时间都没错，目标在大约300 bp，
但有杂band形成，微弱的两条band出现在600、700左右的位置，会是甚麽问题呢?
Western： transfer 电流 250 mA，时间2.5小时，
但Marker只剩下最下面的band被转过去，用CMB染已转的胶上没有蛋白残留。
现在想说继续接一抗，侦测有没有蛋白质过去，但第一次看到这种情形。
想请问有没有高手可以替我解答，感谢。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.44.210.167
1F：推 Ianthegood:PCR有target band出来就好了不要要求太多 桥温度时间 12/16 11:54
2F：→ Ianthegood:离子浓度只是跟自己过不去 12/16 11:54
3F：→ Ianthegood:western不是可以丢ponceau S? 12/16 11:55
4F：→ rayya:ponceau S 我们实验室好像没有，请问一下大概多少呢? 12/17 02:14
5F：推 leoblack:ponceau S很便宜~且可一直reuse~泡一罐可以用很久 12/17 10:26
6F：→ Ianthegood:一次用一瓶都比你一抗便宜吧= = 12/17 19:28
7F：推 pepaduck:细胞会不会是有被霉浆菌之类的污染了,有些试剂可以检测 12/17 21:06
8F：→ pepaduck:PCR我会怀疑是primer不纯,直接请厂商重合给你试试 12/17 21:07
9F：→ pepaduck:Western我觉得可能是没弄紧,转的时候蛋白都掉到buffer里 12/17 21:08
10F：→ pepaduck:滤纸多夹两片再做一次(我以前与过类似问题因此解决了) 12/17 21:09
11F：推 boblu:你 WB "最下面" 指的是分子量最小的？ 12/22 00:22