作者monicatsen (monicatsen)
看板Biotech
標題Re: [求救] 長片段ligation+primer desing
時間Fri Dec 10 22:28:41 2010
剛剛定序結果回來 我的PCR product是我要的target gene沒錯
然後 使用的RE是fastdigest(Fermentas)的產品
目前的策略是打算先做TA
所以 想問一下 我下列的想法對嗎?
因為實驗室的DNA polymerase都是有proofreading功能的enzyme
所以 我想另外買Taq DNA polymerase
然後先用有proofreading功能的酵素跑PCR-->切膠純化
再將純化的PCR產物用Taq做A-tailing 再接到 pGEM-T vector
也麻煩大家推薦一下便宜好用的Taq我只要用來做A-tailing即可~
謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.116.97.104
1F：推 luke12182006:跑完PCR直接做ligation應該也可以吧... 12/10 22:54
2F：→ monicatsen:前篇有寫道因為是接2.3k 接不起來 聽大家的建議才用TA 12/10 23:07
3F：→ untilnow:如果有其他種的勝任細胞，建議試一下，有時候某一種的勝 12/11 00:04
4F：→ untilnow:任細胞就是和某些plasmid不合... 12/11 00:05
5F：推 yaliu:有在賣pfu+Taq混合的polymerase，是叫superTaq嗎？？ 忘了 12/11 00:37
6F：→ yaliu:直接加A理論可以，但我沒真正嘗試過就是了，自己心裡會覺得 12/11 00:39
7F：→ yaliu:怕怕的，就這樣加在一起就會有A了，自己是覺得蠻不確定的XD 12/11 00:40
8F：推 qumai:可以先純化pcr產物 然後加taq跟dATP反應一陣子就會有A了 12/11 01:42
9F：推 Ianthegood:platinum taq是proofreading+A tail阿 先把家裡的 12/11 13:21
10F：→ Ianthegood:enzyme搞清楚吧 不行的話A tailing也不難做 12/11 13:21
11F：→ Ianthegood:室溫過量taq過量A 30min就OK 12/11 13:22
12F：→ monicatsen:我們家的是pfu 所以確定是部會有A tail 確定我要再另外 12/11 14:05
13F：→ monicatsen:做A tailing 總之大家說的我都會再試試 謝 12/11 14:06