作者monicatsen (monicatsen)
看板Biotech
标题Re: [求救] 长片段ligation+primer desing
时间Fri Dec 10 22:28:41 2010
刚刚定序结果回来 我的PCR product是我要的target gene没错
然後 使用的RE是fastdigest(Fermentas)的产品
目前的策略是打算先做TA
所以 想问一下 我下列的想法对吗?
因为实验室的DNA polymerase都是有proofreading功能的enzyme
所以 我想另外买Taq DNA polymerase
然後先用有proofreading功能的酵素跑PCR-->切胶纯化
再将纯化的PCR产物用Taq做A-tailing 再接到 pGEM-T vector
也麻烦大家推荐一下便宜好用的Taq我只要用来做A-tailing即可~
谢谢
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◆ From: 122.116.97.104
1F：推 luke12182006:跑完PCR直接做ligation应该也可以吧... 12/10 22:54
2F：→ monicatsen:前篇有写道因为是接2.3k 接不起来 听大家的建议才用TA 12/10 23:07
3F：→ untilnow:如果有其他种的胜任细胞，建议试一下，有时候某一种的胜 12/11 00:04
4F：→ untilnow:任细胞就是和某些plasmid不合... 12/11 00:05
5F：推 yaliu:有在卖pfu+Taq混合的polymerase，是叫superTaq吗？？ 忘了 12/11 00:37
6F：→ yaliu:直接加A理论可以，但我没真正尝试过就是了，自己心里会觉得 12/11 00:39
7F：→ yaliu:怕怕的，就这样加在一起就会有A了，自己是觉得蛮不确定的XD 12/11 00:40
8F：推 qumai:可以先纯化pcr产物 然後加taq跟dATP反应一阵子就会有A了 12/11 01:42
9F：推 Ianthegood:platinum taq是proofreading+A tail阿 先把家里的 12/11 13:21
10F：→ Ianthegood:enzyme搞清楚吧 不行的话A tailing也不难做 12/11 13:21
11F：→ Ianthegood:室温过量taq过量A 30min就OK 12/11 13:22
12F：→ monicatsen:我们家的是pfu 所以确定是部会有A tail 确定我要再另外 12/11 14:05
13F：→ monicatsen:做A tailing 总之大家说的我都会再试试 谢 12/11 14:06