作者ennnnno (小玲)
看板Biotech
標題[求救] 請問ligation
時間Mon Dec 6 20:17:39 2010
大家好...
剛剛爬了文...參考了很多人ligation的作法
不過我有一點疑問
我是用PGEM_T vector (promega) 3k
insert DNA 2K,比例vector:insert=1:4
經藍白篩之後, clone的數量也是很少><
ligation是 16度 overnight
想請問大家以下的問題:
1.pcr產物一定要先經過純化嗎?
問這個主要是因為我記得碩士clone時好像沒將pcr產物純化
直接和pgem t vector做ligation
不過在現在的實驗室要,想請問有無純化真的有差別嗎?
因為我gel extraction的濃度會變的很低
一開始pcr會p大概五管左右,再全部濃縮成50μl
跑膠完其實band還蠻清楚的,但是gel elute完後再取約2μl跑膠
band很弱,做了兩次都一樣,實在不知道問題是什麼
是用QIA的KIT去純化的
所以想問問看是否一定要先經過純化?
2.gel extraction為何濃度會那麼低呢?
都是造protocol去操作的, 到底問題是....?
先謝謝大家了,遲遲clone不出來好沮喪啊>"<
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◆ From: 220.136.22.186
1F：→ Ianthegood:最後beads overdry跟pH不對是最常見的吧 12/06 20:21
2F：→ tsubasawolfy:1.PCR純化可以去除PCR過程中產生的non-specfic band 12/06 21:50
3F：→ tsubasawolfy:2. 看人品看kit穩定度看band的粗細看切下來膠的大小 12/06 21:51
4F：→ tsubasawolfy:看做膠的品質跟融點 通常有回收一半就不錯了 12/06 21:51
5F：→ blence:正常使用gel extraction kit效果不只一半,product不要太大 12/06 22:06
6F：→ blence:太小的話,都可以有8成,最大的問題是做cloning的貪心,很多人 12/06 22:07
7F：→ blence:用過少的elution buffer想要得到高濃度,殊不知是反效果 12/06 22:08
8F：推 iceking:當然要純化,不純化做得出來我只能說是運氣 12/07 13:10
9F：→ iceking:2ul跑膠band當然暗,你一定是體積加太少,不敢多取來跑膠 12/07 13:13
10F：→ iceking:還有切下的膠一定要小純化的效果才比較好 12/07 13:14
11F：→ iceking:還有enzyme作用完,ligation前也一定要純化,我是用酒精沉澱 12/07 13:17
12F：推 yaliu:如果是single band的話，可以用clean up，回收率比切膠多 12/07 17:44
13F：→ yaliu:不然只能用切的了，sample可以集多一點去elute，切膠純化就 12/07 17:44
14F：→ yaliu:不會覺得不夠了～基本上我都是PCR產物用100ul去elution 12/07 17:45
15F：→ yaliu:最後用20-30ul "水"回溶，建議不要用TE buffer或kit的buffer 12/07 17:46
16F：→ yaliu:溶，會干擾反應 12/07 17:47
17F：推 iceking:Kit的buffer其實也就是Tris而已,不含EDTA不會影響後面實驗 12/07 18:07
18F：推 fcku413:除非你P的很多雜BAND 不然通常不需要gel extraction吧@@ 12/10 02:02
19F：推 qumai:推樓上 沒雜BAND的話 直接用pcr cleaning kit 回收率高很多 12/10 18:13