作者ennnnno (小玲)
看板Biotech
标题[求救] 请问ligation
时间Mon Dec 6 20:17:39 2010
大家好...
刚刚爬了文...参考了很多人ligation的作法
不过我有一点疑问
我是用PGEM_T vector (promega) 3k
insert DNA 2K,比例vector:insert=1:4
经蓝白筛之後, clone的数量也是很少><
ligation是 16度 overnight
想请问大家以下的问题:
1.pcr产物一定要先经过纯化吗?
问这个主要是因为我记得硕士clone时好像没将pcr产物纯化
直接和pgem t vector做ligation
不过在现在的实验室要,想请问有无纯化真的有差别吗?
因为我gel extraction的浓度会变的很低
一开始pcr会p大概五管左右,再全部浓缩成50μl
跑胶完其实band还蛮清楚的,但是gel elute完後再取约2μl跑胶
band很弱,做了两次都一样,实在不知道问题是什麽
是用QIA的KIT去纯化的
所以想问问看是否一定要先经过纯化?
2.gel extraction为何浓度会那麽低呢?
都是造protocol去操作的, 到底问题是....?
先谢谢大家了,迟迟clone不出来好沮丧啊>"<
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.136.22.186
1F：→ Ianthegood:最後beads overdry跟pH不对是最常见的吧 12/06 20:21
2F：→ tsubasawolfy:1.PCR纯化可以去除PCR过程中产生的non-specfic band 12/06 21:50
3F：→ tsubasawolfy:2. 看人品看kit稳定度看band的粗细看切下来胶的大小 12/06 21:51
4F：→ tsubasawolfy:看做胶的品质跟融点 通常有回收一半就不错了 12/06 21:51
5F：→ blence:正常使用gel extraction kit效果不只一半,product不要太大 12/06 22:06
6F：→ blence:太小的话,都可以有8成,最大的问题是做cloning的贪心,很多人 12/06 22:07
7F：→ blence:用过少的elution buffer想要得到高浓度,殊不知是反效果 12/06 22:08
8F：推 iceking:当然要纯化,不纯化做得出来我只能说是运气 12/07 13:10
9F：→ iceking:2ul跑胶band当然暗,你一定是体积加太少,不敢多取来跑胶 12/07 13:13
10F：→ iceking:还有切下的胶一定要小纯化的效果才比较好 12/07 13:14
11F：→ iceking:还有enzyme作用完,ligation前也一定要纯化,我是用酒精沉淀 12/07 13:17
12F：推 yaliu:如果是single band的话，可以用clean up，回收率比切胶多 12/07 17:44
13F：→ yaliu:不然只能用切的了，sample可以集多一点去elute，切胶纯化就 12/07 17:44
14F：→ yaliu:不会觉得不够了～基本上我都是PCR产物用100ul去elution 12/07 17:45
15F：→ yaliu:最後用20-30ul "水"回溶，建议不要用TE buffer或kit的buffer 12/07 17:46
16F：→ yaliu:溶，会干扰反应 12/07 17:47
17F：推 iceking:Kit的buffer其实也就是Tris而已,不含EDTA不会影响後面实验 12/07 18:07
18F：推 fcku413:除非你P的很多杂BAND 不然通常不需要gel extraction吧@@ 12/10 02:02
19F：推 qumai:推楼上 没杂BAND的话 直接用pcr cleaning kit 回收率高很多 12/10 18:13