作者FDynasty (a chain of stories )
看板Biotech
標題[求救] 限制酶反應產物卡在well處
時間Mon Dec 6 19:44:06 2010
最近有幾次做RE digestion (Fok1, NEB) (切割對象為600bp PCR products)
跑膠看產物,都發現產量比預期低很多,而且在well下緣卡著頗亮的訊號
今天做出來的更慘烈,發生亂切,切出比理論產物大小小了一半的東東
我的反應條件是:
Final conc. uL/tube
DDW 19.4
PCR product (182.5 ng/uL) 4.47 ug/rxn 24.5
10x NEB buffer 4 1x 5
Fok1 (4U/uL) 4.4 Units 1.1
Steps:
1. 37度c 水浴一小時
2. 65度c heat inactivate 20 min
#這個enzyme的特性是不可切超過1hr 每1ug DNA不可用超過1U
##enzyme和buffer到現在已經用了快半年了,最近一個才開始有這問題
###有一點比較怪異的是,PCR products純化後測O.D.，得到的260/280 ratio只有1.1x
不過因為跑膠結果很正常,我就還是拿來用了
####PCR purification kit是基隆米克斯的
有人有遇過像這種每次digestion不穩定,well卡東西的情況嗎？
我回想過程中比較可能有問題的地方是吸取enzyme的時候,
每次吸這種微量黏稠藥品時都很擔心會不會黏附過量....
不知道有沒有比較精準的吸法
還請大家指點orz 感激不盡
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.4.195
※ 編輯: FDynasty 來自: 140.112.4.195 (12/06 19:44)
※ 編輯: FDynasty 來自: 140.112.4.195 (12/06 19:45)
※ 編輯: FDynasty 來自: 140.112.4.195 (12/06 19:53)
1F：推 Ianthegood:clone起來送定序阿 搞不好要拿諾貝爾獎了 12/06 20:19
2F：推 tsubasawolfy:酵素壞了沒切開才卡在well吧... 12/06 21:49
3F：推 bluecsky:可是他切的東西不是才600bp? 600bp沒切怎可能卡well 12/07 00:26
4F：→ bluecsky:一般卡DNA agarose gel的 大多是protein吧 12/07 00:26
5F：→ bluecsky:我猜測是你的DNA現在很不純 甚至可能混了Dnase之類的 12/07 00:27
6F：→ bluecsky:有沒有換過新的水去回溶DNA之類的 我猜有可能汙染 12/07 00:28
7F：→ bluecsky:要不然就是那管enzyme或buffer進進出出被汙染或壞了 12/07 00:28
8F：→ bluecsky:以上只是推測 我沒實際去看過試過只從你得敘述推估 12/07 00:29
嗯嗯感謝,我今天把buffer全部換新來重做一次看看
比較困惑的是卡well的protein會被SYBR染到嗎...?感覺真的有DNA被"綁架"在well.
※ 編輯: FDynasty 來自: 140.112.52.126 (12/07 10:23)