作者FDynasty (a chain of stories )
看板Biotech
标题[求救] 限制酶反应产物卡在well处
时间Mon Dec 6 19:44:06 2010
最近有几次做RE digestion (Fok1, NEB) (切割对象为600bp PCR products)
跑胶看产物,都发现产量比预期低很多,而且在well下缘卡着颇亮的讯号
今天做出来的更惨烈,发生乱切,切出比理论产物大小小了一半的东东
我的反应条件是:
Final conc. uL/tube
DDW 19.4
PCR product (182.5 ng/uL) 4.47 ug/rxn 24.5
10x NEB buffer 4 1x 5
Fok1 (4U/uL) 4.4 Units 1.1
Steps:
1. 37度c 水浴一小时
2. 65度c heat inactivate 20 min
#这个enzyme的特性是不可切超过1hr 每1ug DNA不可用超过1U
##enzyme和buffer到现在已经用了快半年了,最近一个才开始有这问题
###有一点比较怪异的是,PCR products纯化後测O.D.，得到的260/280 ratio只有1.1x
不过因为跑胶结果很正常,我就还是拿来用了
####PCR purification kit是基隆米克斯的
有人有遇过像这种每次digestion不稳定,well卡东西的情况吗？
我回想过程中比较可能有问题的地方是吸取enzyme的时候,
每次吸这种微量黏稠药品时都很担心会不会黏附过量....
不知道有没有比较精准的吸法
还请大家指点orz 感激不尽
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.4.195
※ 编辑: FDynasty 来自: 140.112.4.195 (12/06 19:44)
※ 编辑: FDynasty 来自: 140.112.4.195 (12/06 19:45)
※ 编辑: FDynasty 来自: 140.112.4.195 (12/06 19:53)
1F：推 Ianthegood:clone起来送定序阿 搞不好要拿诺贝尔奖了 12/06 20:19
2F：推 tsubasawolfy:酵素坏了没切开才卡在well吧... 12/06 21:49
3F：推 bluecsky:可是他切的东西不是才600bp? 600bp没切怎可能卡well 12/07 00:26
4F：→ bluecsky:一般卡DNA agarose gel的 大多是protein吧 12/07 00:26
5F：→ bluecsky:我猜测是你的DNA现在很不纯 甚至可能混了Dnase之类的 12/07 00:27
6F：→ bluecsky:有没有换过新的水去回溶DNA之类的 我猜有可能污染 12/07 00:28
7F：→ bluecsky:要不然就是那管enzyme或buffer进进出出被污染或坏了 12/07 00:28
8F：→ bluecsky:以上只是推测 我没实际去看过试过只从你得叙述推估 12/07 00:29
嗯嗯感谢,我今天把buffer全部换新来重做一次看看
比较困惑的是卡well的protein会被SYBR染到吗...?感觉真的有DNA被"绑架"在well.
※ 编辑: FDynasty 来自: 140.112.52.126 (12/07 10:23)