作者nk12914 (等待)
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標題[求救] RNA level和WB的結果兜不起來
時間Sun Nov 28 23:26:09 2010
最近用四株cancer cee lines(暫命名為為A、B、C、D)在看一個chemokine receptor
一開始我先用Q-PCR去分析四株cell lines receptor的表現量
Ct值分別約為
A:32
B:24
C:32
D:32
後來我用WB去check protein的表現量
壓出來的結果竟然是A、B、D表現量差不多，甚至D細胞的表現量更比B細胞來的多
老闆對於這樣的結果很不滿意，但我壓了好幾次，RNA跟protein的結果就是兜不起來
我也查過GOOGLE，試圖尋找其他paper也是用D細胞來做WB，但沒有任何結果
實在不知道是哪裡出了問題???
我推測的可能原因會不會是我WB看的位置根本就是錯的??
我查過NCBI該receptor的資訊，確實他有兩個isoform a和b，但兩分子量差不到1kD
Ab datasheet 所看的band大約是在43kD，實際上我看到的位置是介於marker 43-55中間
而那家抗體的網址中也有一些reference看的位置跟我的是比較接近
反而不像datasheet中那麼剛好就在43的位置上
這讓我更陷入疑惑中.........
我也無法跟老闆解釋為何Ct值32的結果，protein的表現量卻那麼高......
希望有遇過這樣經驗的人或是各位大大能一起討論!!!非常感激!!!!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.45.52.205
1F：推 soom:RNA跟protein level兜不起來很正常，中間還有很多調控機制 11/28 23:28
2F：推 aceliang:post-translational alteration 11/28 23:31
3F：推 tsubasawolfy:這很正常Orz 11/28 23:53
4F：→ nk12914:我能理解的是RNA表現多但protein表現量少，但相反的話也是 11/28 23:53
5F：→ nk12914:能用樓上二位先進的理由解釋嗎? 11/28 23:54
6F：推 hangzer:這還滿正常的除了PTM以外 post-transcription regulation 11/28 23:56
7F：→ hangzer:也會調控 所以RNA-protein level常常會有差別 11/28 23:56
8F：→ nk12914:只是老闆總是一廂情願認為就是應該要一樣，不然怪罪的理由 11/29 00:13
9F：→ nk12914:就是技術不好 囧 11/29 00:13
10F：→ saviora:拿paper讓老闆知道生物不是只有他想的那樣 11/29 08:14
11F：推 icome:還要考慮protein stability 拿資料說服你老闆吧 11/29 12:18
12F：推 Danielle:我建議你檢查幾個項目, (1)QPCR的產物是否真的是你要的 11/29 16:32
13F：→ Danielle:(2) WB看到的bend是否為真 (可用KD/overexpress証明) 11/29 16:33
14F：→ Danielle:如果一切正確無誤, 你可能要"證明"或提出合理詳細的假設 11/29 16:34
15F：→ Danielle:光是跟老闆講"生物不是這麼簡單"是沒用的....<-過來人 11/29 16:35
16F：推 desirable:……你們老闆需要多讀一點書@@，每種cell line 的RNA/ 11/29 19:32
17F：→ desirable:protein 的stability 都不見得一樣呀！何況還有PTM 之類 11/29 19:32
18F：→ desirable:的一堆問題…… 如果你能確認不是你技術上的問題，就多 11/29 19:33
19F：→ desirable:找一些 reference 說服你老闆吧！（加油保重） 11/29 19:33
20F：→ desirable:樓上D大的意見不錯。 11/29 19:35
21F：→ nk12914:謝謝樓上大家的意見跟指教，我會試試看Dan大的方式^^ 11/30 00:10
22F：→ reinherd:可以把你要看的protein名稱加上 post translational regu 11/30 08:20
23F：→ reinherd:lation 一起google 我也碰過這種事 很司空見慣 11/30 08:21