作者nk12914 (等待)
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标题[求救] RNA level和WB的结果兜不起来
时间Sun Nov 28 23:26:09 2010
最近用四株cancer cee lines(暂命名为为A、B、C、D)在看一个chemokine receptor
一开始我先用Q-PCR去分析四株cell lines receptor的表现量
Ct值分别约为
A:32
B:24
C:32
D:32
後来我用WB去check protein的表现量
压出来的结果竟然是A、B、D表现量差不多，甚至D细胞的表现量更比B细胞来的多
老板对於这样的结果很不满意，但我压了好几次，RNA跟protein的结果就是兜不起来
我也查过GOOGLE，试图寻找其他paper也是用D细胞来做WB，但没有任何结果
实在不知道是哪里出了问题???
我推测的可能原因会不会是我WB看的位置根本就是错的??
我查过NCBI该receptor的资讯，确实他有两个isoform a和b，但两分子量差不到1kD
Ab datasheet 所看的band大约是在43kD，实际上我看到的位置是介於marker 43-55中间
而那家抗体的网址中也有一些reference看的位置跟我的是比较接近
反而不像datasheet中那麽刚好就在43的位置上
这让我更陷入疑惑中.........
我也无法跟老板解释为何Ct值32的结果，protein的表现量却那麽高......
希望有遇过这样经验的人或是各位大大能一起讨论!!!非常感激!!!!!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.45.52.205
1F：推 soom:RNA跟protein level兜不起来很正常，中间还有很多调控机制 11/28 23:28
2F：推 aceliang:post-translational alteration 11/28 23:31
3F：推 tsubasawolfy:这很正常Orz 11/28 23:53
4F：→ nk12914:我能理解的是RNA表现多但protein表现量少，但相反的话也是 11/28 23:53
5F：→ nk12914:能用楼上二位先进的理由解释吗? 11/28 23:54
6F：推 hangzer:这还满正常的除了PTM以外 post-transcription regulation 11/28 23:56
7F：→ hangzer:也会调控 所以RNA-protein level常常会有差别 11/28 23:56
8F：→ nk12914:只是老板总是一厢情愿认为就是应该要一样，不然怪罪的理由 11/29 00:13
9F：→ nk12914:就是技术不好 囧 11/29 00:13
10F：→ saviora:拿paper让老板知道生物不是只有他想的那样 11/29 08:14
11F：推 icome:还要考虑protein stability 拿资料说服你老板吧 11/29 12:18
12F：推 Danielle:我建议你检查几个项目, (1)QPCR的产物是否真的是你要的 11/29 16:32
13F：→ Danielle:(2) WB看到的bend是否为真 (可用KD/overexpress证明) 11/29 16:33
14F：→ Danielle:如果一切正确无误, 你可能要"证明"或提出合理详细的假设 11/29 16:34
15F：→ Danielle:光是跟老板讲"生物不是这麽简单"是没用的....<-过来人 11/29 16:35
16F：推 desirable:……你们老板需要多读一点书@@，每种cell line 的RNA/ 11/29 19:32
17F：→ desirable:protein 的stability 都不见得一样呀！何况还有PTM 之类 11/29 19:32
18F：→ desirable:的一堆问题…… 如果你能确认不是你技术上的问题，就多 11/29 19:33
19F：→ desirable:找一些 reference 说服你老板吧！（加油保重） 11/29 19:33
20F：→ desirable:楼上D大的意见不错。 11/29 19:35
21F：→ nk12914:谢谢楼上大家的意见跟指教，我会试试看Dan大的方式^^ 11/30 00:10
22F：→ reinherd:可以把你要看的protein名称加上 post translational regu 11/30 08:20
23F：→ reinherd:lation 一起google 我也碰过这种事 很司空见惯 11/30 08:21