作者kutoushinji (黑嚕嚕)
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標題[求救] 我的PCR有Negative control的問題?
時間Mon Nov 22 05:08:22 2010
各位大大
我最近跑PCR的negative control都會有band，我們實驗室其他人也都遇到一樣的問題
而且band的大小每個人都不一樣，都剛剛好跟自己主要sample P出來的大小一樣
我試了一些方法想找出原因，但是結果越來越奇怪
我先說明一下大致的方法：
我的negative control是用DDW(滅過菌並分裝)當template
兩股primer也都會從stock中分裝出來，primer夾出來片段的大小約900bp
Taq酵素的使用非常頻繁，應該不會有汙染的狀況
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實驗的材料做一個說明
我的DDW分為 舊DDW(原本使用的)及新DDW(新分裝到tube中)
primer分為 舊primer及新primer
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第一個實驗：有加我的樣品一起跑，但是NC都是先加的
NC:舊DDW+舊primer
結果：NC跟我的樣品跑出一樣大小的band
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第二個實驗：純粹跑舊DDW+舊primer (不加其他sample) 跑11管
結果：全部都有大約900bp淡淡的band
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第三個實驗：有舊DDW.新DDW+舊primer.新primer
sample 結果(O.X) O代表有band;X代表沒有band
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1.舊DDW+新primer F+R X
2.舊DDW+新primer F X
3.舊DDW+新primer R X
4.舊DDW X
5.新DDW X
6.新DDW+舊primer F+R O
7.新DDW+新primer F+R O
所以懷疑是新的水有汙染
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第四個實驗：
sample 結果
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1.舊DDW+舊primer F+R X -與第1.2次實驗不符
2.舊DDW+新primer F+R O -與第3次實驗不符
3.新DDW+舊primer F+R O
4.新DDW+新primer F+R O
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真的非常感謝耐心看完以上內容的大家
我寫的不知道大家有沒有了解
如果看懂我打的內容，希望可以給我一些建議
因為要做分析實驗，所以需要NC
如果解決不了，其他的data都不準確
拜託!!拜託!!
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◆ From: 61.227.162.43
1F：推 match308:以前有沒有人做過類似的sample呢 有的話可能是從舊sample 11/22 05:22
2F：→ match308:還在環境中造成的contamination,試看看去其他bench操作 11/22 05:23
3F：→ match308:完全隔絕你現在用的東西,置於實驗的不一致,可能跟每次 11/22 05:24
4F：→ match308:contamination多少和primers bind到contaminants上的狀況 11/22 05:26
5F：→ match308:不同而異吧 11/22 05:26
6F：推 h3250sam:酵素使用頻繁是指很快就會用完嗎? 不然在共用情況下 11/22 06:08
7F：→ h3250sam:又使用頻繁 很容易有汙染的情形 11/22 06:09
8F：→ kutoushinji:實驗室有其他人拿自己ㄉsample去間lab做,NC一樣會跑出 11/22 12:34
9F：→ kutoushinji:跟他sample一樣大小的band,酵素是買混好buffer的,所以 11/22 12:36
10F：→ kutoushinji:平均一管不到一個禮拜就用完了,且我第一個實驗跟第二 11/22 12:37
11F：→ kutoushinji:個實驗用的酵素都不同管,我都是第一個開封的人 11/22 12:38
12F：→ kutoushinji:我甚至跑到操作台裡面做NC也會有BAND 11/22 12:39
13F：推 bider:pipetman也是用其它lab的嗎 11/22 17:42
14F：推 hilarity:用filter tip看看是不是pipet的問題 11/22 19:38
15F：→ kutoushinji:去其他lab就是用他們lab的pipetman與tip 11/22 22:13
16F：推 yaliu:看你第四個實驗，很像是水的問題...瓶子洗一洗，重新裝水吧 11/22 22:26
17F：→ yaliu:primer再重新稀釋 11/22 22:26
18F：推 conective:primer是用什麼水稀釋的？ 11/23 09:53
19F：→ kutoushinji:我們的primer都是用TE稀釋的,目前我把primer跟水都換 11/24 02:39
20F：→ kutoushinji:過了,而且都拿去曬UV,目前結果是OK的!希望可以維持久 11/24 02:41
21F：→ kutoushinji:一點(曬UV的只有水)謝謝大家提供的意見!!! 11/24 02:42
22F：推 sunnyforever:小建議供參考 先以乾淨的血清瓶裝水(100ml即可) 11/24 13:32
23F：→ sunnyforever:滅完後再以1.5ml tube分裝供PCR相關使用 11/24 13:33
24F：→ sunnyforever:如此較可確保不會因公用而汙染這些物品 11/24 13:34
25F：→ sunnyforever:不過比較耗tube就對了~參考囉! 11/24 13:34
26F：推 yaliu:推樓上，我之前都是這樣做的～反正水很便宜，用完一次就丟了 11/24 23:52