作者kutoushinji (黑噜噜)
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标题[求救] 我的PCR有Negative control的问题?
时间Mon Nov 22 05:08:22 2010
各位大大
我最近跑PCR的negative control都会有band，我们实验室其他人也都遇到一样的问题
而且band的大小每个人都不一样，都刚刚好跟自己主要sample P出来的大小一样
我试了一些方法想找出原因，但是结果越来越奇怪
我先说明一下大致的方法：
我的negative control是用DDW(灭过菌并分装)当template
两股primer也都会从stock中分装出来，primer夹出来片段的大小约900bp
Taq酵素的使用非常频繁，应该不会有污染的状况
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实验的材料做一个说明
我的DDW分为 旧DDW(原本使用的)及新DDW(新分装到tube中)
primer分为 旧primer及新primer
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第一个实验：有加我的样品一起跑，但是NC都是先加的
NC:旧DDW+旧primer
结果：NC跟我的样品跑出一样大小的band
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第二个实验：纯粹跑旧DDW+旧primer (不加其他sample) 跑11管
结果：全部都有大约900bp淡淡的band
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第三个实验：有旧DDW.新DDW+旧primer.新primer
sample 结果(O.X) O代表有band;X代表没有band
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1.旧DDW+新primer F+R X
2.旧DDW+新primer F X
3.旧DDW+新primer R X
4.旧DDW X
5.新DDW X
6.新DDW+旧primer F+R O
7.新DDW+新primer F+R O
所以怀疑是新的水有污染
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第四个实验：
sample 结果
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1.旧DDW+旧primer F+R X -与第1.2次实验不符
2.旧DDW+新primer F+R O -与第3次实验不符
3.新DDW+旧primer F+R O
4.新DDW+新primer F+R O
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真的非常感谢耐心看完以上内容的大家
我写的不知道大家有没有了解
如果看懂我打的内容，希望可以给我一些建议
因为要做分析实验，所以需要NC
如果解决不了，其他的data都不准确
拜托!!拜托!!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.227.162.43
1F：推 match308:以前有没有人做过类似的sample呢 有的话可能是从旧sample 11/22 05:22
2F：→ match308:还在环境中造成的contamination,试看看去其他bench操作 11/22 05:23
3F：→ match308:完全隔绝你现在用的东西,置於实验的不一致,可能跟每次 11/22 05:24
4F：→ match308:contamination多少和primers bind到contaminants上的状况 11/22 05:26
5F：→ match308:不同而异吧 11/22 05:26
6F：推 h3250sam:酵素使用频繁是指很快就会用完吗? 不然在共用情况下 11/22 06:08
7F：→ h3250sam:又使用频繁 很容易有污染的情形 11/22 06:09
8F：→ kutoushinji:实验室有其他人拿自己ㄉsample去间lab做,NC一样会跑出 11/22 12:34
9F：→ kutoushinji:跟他sample一样大小的band,酵素是买混好buffer的,所以 11/22 12:36
10F：→ kutoushinji:平均一管不到一个礼拜就用完了,且我第一个实验跟第二 11/22 12:37
11F：→ kutoushinji:个实验用的酵素都不同管,我都是第一个开封的人 11/22 12:38
12F：→ kutoushinji:我甚至跑到操作台里面做NC也会有BAND 11/22 12:39
13F：推 bider:pipetman也是用其它lab的吗 11/22 17:42
14F：推 hilarity:用filter tip看看是不是pipet的问题 11/22 19:38
15F：→ kutoushinji:去其他lab就是用他们lab的pipetman与tip 11/22 22:13
16F：推 yaliu:看你第四个实验，很像是水的问题...瓶子洗一洗，重新装水吧 11/22 22:26
17F：→ yaliu:primer再重新稀释 11/22 22:26
18F：推 conective:primer是用什麽水稀释的？ 11/23 09:53
19F：→ kutoushinji:我们的primer都是用TE稀释的,目前我把primer跟水都换 11/24 02:39
20F：→ kutoushinji:过了,而且都拿去晒UV,目前结果是OK的!希望可以维持久 11/24 02:41
21F：→ kutoushinji:一点(晒UV的只有水)谢谢大家提供的意见!!! 11/24 02:42
22F：推 sunnyforever:小建议供参考 先以乾净的血清瓶装水(100ml即可) 11/24 13:32
23F：→ sunnyforever:灭完後再以1.5ml tube分装供PCR相关使用 11/24 13:33
24F：→ sunnyforever:如此较可确保不会因公用而污染这些物品 11/24 13:34
25F：→ sunnyforever:不过比较耗tube就对了~参考罗! 11/24 13:34
26F：推 yaliu:推楼上，我之前都是这样做的～反正水很便宜，用完一次就丢了 11/24 23:52