作者DJHINN (dj)
看板Biotech
標題[求救] ligation 的問題
時間Fri Nov 19 11:10:13 2010
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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我用的材料是 pGEM T easy vector (3K)
insert長度大約 2.4K
現在問題是，我加完所有ligation 的solution後
放在室溫約 6 hr後才放進 4度C冰箱.......
請問這樣還有救嗎?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 111.240.131.123
1F：→ saviora:試一下囉 ligase在4度活性會降低很多 11/19 11:35
2F：推 spirithorse:ligation最好是16度,如果隔兩天才要transform的話, 11/19 12:15
3F：→ spirithorse:我就放冰箱,隔天要transform就放室溫 11/19 12:15
4F：→ spirithorse:我學到的好像是差在碰撞機率耶... 11/19 12:16
5F：→ DJHINN:其實 各家的protocol都不太一樣 有16度 overnight和 4度 11/19 12:19
6F：→ DJHINN:我是有得到一個答案，室溫可能已經working完了..... 11/19 12:20
7F：→ DJHINN:在低溫的狀況，ligase的活性較低，因此可以慢慢的ligation 11/19 12:20
8F：→ DJHINN:以得到最大效率!? 我的思考是這樣 = =" 11/19 12:21
9F：推 tsubasawolfy:pGEM Teasy這套不是rt一小時就可以長一堆嘛？ 11/19 12:28
10F：→ qumai:室溫也是可以反應的~ 繼續做吧 11/19 12:34
11F：→ DJHINN:恩....但是最高效率還是4度C啊 XD 而且我的insert長了那 11/19 12:39
12F：→ DJHINN:麼一點 有點心慌 XD 11/19 12:39
13F：推 tsubasawolfy:這套有沒有4度 ON其實都一樣 最大差別在transform 11/19 12:42
14F：→ tsubasawolfy:recover的時候SOC跟LB差很多 11/19 12:42
15F：推 icome:室溫一小時就可以了 11/19 13:39
16F：推 missal:做過室溫十分鐘... 11/19 13:50
17F：→ DJHINN:我在 transform 用的是commercial的comptent cell 11/19 14:38
18F：→ DJHINN:並沒有用到 SOC，而是直接transform在LB上，樓上的大大 11/19 14:39
19F：→ DJHINN:是要我另外加上SOC嗎? 11/19 14:39
20F：→ DJHINN:= = commercial的competent裡面應該就有SOC了吧 XD 11/19 14:40
21F：推 tsubasawolfy:................ 11/19 14:42
22F：推 sunnyforever:樓上息怒XD t大指的是medium用SOC比用LB更好 11/19 14:57
23F：→ sunnyforever:所以heatshock完放冰上以後加SOC再incubation 11/19 14:59
24F：推 miaw:其實如果用heat shock~幾乎不用修復耶! ^^" 11/19 15:04
25F：→ miaw:我都直就塗plate了~ 11/19 15:04
26F：→ DJHINN:所以 我才說 我用commercial的根本就沒有recovery的步驟 11/19 15:06
27F：→ DJHINN:他heatshock後直接塗在 "預冷"的plate上 (算一種recovery? 11/19 15:07
※ 編輯: DJHINN 來自: 140.112.80.2 (11/19 15:10)
28F：→ DJHINN:所以 另外用SOC 處理會比較好就對了 = =? 11/19 15:11
29F：推 miaw:個人經驗,當年電菌後修復,用LB跟SOC長的colony量差不多~ 11/19 15:18
30F：→ DJHINN:我只是 heat shock啊 XD 11/19 15:21
31F：→ saviora:低溫下annealing會比較好 ligation效率變差 11/19 15:26
32F：→ saviora:低溫下annealing會比較好 ligation效率變差 11/19 15:36
33F：→ saviora:溫度較高下則相反 11/19 15:37
34F：推 tsubasawolfy:我說的soc跟LB是用他附的的comptent cell 11/19 15:47
35F：推 tsubasawolfy:而且他也有寫9. Incubate for 1.5 hours at 37°C 11/19 15:50
36F：→ DJHINN:我用的 是 yeasten的 competent cell.... 11/19 16:21
37F：→ DJHINN:不好意思....我發現...我LA打成LB 了 ...對不起 = =+ 11/19 16:28
38F：推 sunnyforever:搞了半天是yeastXDD 11/19 21:59
39F：推 sunnyforever: yeasten 11/19 22:02
40F：推 sunnyforever:這樣應該依照各家廠商的protocol為基準會比較恰當吧 11/19 22:07