作者DJHINN (dj)
看板Biotech
标题[求救] ligation 的问题
时间Fri Nov 19 11:10:13 2010
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
我用的材料是 pGEM T easy vector (3K)
insert长度大约 2.4K
现在问题是，我加完所有ligation 的solution後
放在室温约 6 hr後才放进 4度C冰箱.......
请问这样还有救吗?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 111.240.131.123
1F：→ saviora:试一下罗 ligase在4度活性会降低很多 11/19 11:35
2F：推 spirithorse:ligation最好是16度,如果隔两天才要transform的话, 11/19 12:15
3F：→ spirithorse:我就放冰箱,隔天要transform就放室温 11/19 12:15
4F：→ spirithorse:我学到的好像是差在碰撞机率耶... 11/19 12:16
5F：→ DJHINN:其实 各家的protocol都不太一样 有16度 overnight和 4度 11/19 12:19
6F：→ DJHINN:我是有得到一个答案，室温可能已经working完了..... 11/19 12:20
7F：→ DJHINN:在低温的状况，ligase的活性较低，因此可以慢慢的ligation 11/19 12:20
8F：→ DJHINN:以得到最大效率!? 我的思考是这样 = =" 11/19 12:21
9F：推 tsubasawolfy:pGEM Teasy这套不是rt一小时就可以长一堆嘛？ 11/19 12:28
10F：→ qumai:室温也是可以反应的~ 继续做吧 11/19 12:34
11F：→ DJHINN:恩....但是最高效率还是4度C啊 XD 而且我的insert长了那 11/19 12:39
12F：→ DJHINN:麽一点 有点心慌 XD 11/19 12:39
13F：推 tsubasawolfy:这套有没有4度 ON其实都一样 最大差别在transform 11/19 12:42
14F：→ tsubasawolfy:recover的时候SOC跟LB差很多 11/19 12:42
15F：推 icome:室温一小时就可以了 11/19 13:39
16F：推 missal:做过室温十分钟... 11/19 13:50
17F：→ DJHINN:我在 transform 用的是commercial的comptent cell 11/19 14:38
18F：→ DJHINN:并没有用到 SOC，而是直接transform在LB上，楼上的大大 11/19 14:39
19F：→ DJHINN:是要我另外加上SOC吗? 11/19 14:39
20F：→ DJHINN:= = commercial的competent里面应该就有SOC了吧 XD 11/19 14:40
21F：推 tsubasawolfy:................ 11/19 14:42
22F：推 sunnyforever:楼上息怒XD t大指的是medium用SOC比用LB更好 11/19 14:57
23F：→ sunnyforever:所以heatshock完放冰上以後加SOC再incubation 11/19 14:59
24F：推 miaw:其实如果用heat shock~几乎不用修复耶! ^^" 11/19 15:04
25F：→ miaw:我都直就涂plate了~ 11/19 15:04
26F：→ DJHINN:所以 我才说 我用commercial的根本就没有recovery的步骤 11/19 15:06
27F：→ DJHINN:他heatshock後直接涂在 "预冷"的plate上 (算一种recovery? 11/19 15:07
※ 编辑: DJHINN 来自: 140.112.80.2 (11/19 15:10)
28F：→ DJHINN:所以 另外用SOC 处理会比较好就对了 = =? 11/19 15:11
29F：推 miaw:个人经验,当年电菌後修复,用LB跟SOC长的colony量差不多~ 11/19 15:18
30F：→ DJHINN:我只是 heat shock啊 XD 11/19 15:21
31F：→ saviora:低温下annealing会比较好 ligation效率变差 11/19 15:26
32F：→ saviora:低温下annealing会比较好 ligation效率变差 11/19 15:36
33F：→ saviora:温度较高下则相反 11/19 15:37
34F：推 tsubasawolfy:我说的soc跟LB是用他附的的comptent cell 11/19 15:47
35F：推 tsubasawolfy:而且他也有写9. Incubate for 1.5 hours at 37°C 11/19 15:50
36F：→ DJHINN:我用的 是 yeasten的 competent cell.... 11/19 16:21
37F：→ DJHINN:不好意思....我发现...我LA打成LB 了 ...对不起 = =+ 11/19 16:28
38F：推 sunnyforever:搞了半天是yeastXDD 11/19 21:59
39F：推 sunnyforever: yeasten 11/19 22:02
40F：推 sunnyforever:这样应该依照各家厂商的protocol为基准会比较恰当吧 11/19 22:07