作者wkj1020 (Aj)
看板Biotech
標題[求救] IRES與雙CMV promoter
時間Thu Nov 11 17:00:02 2010
小弟目前在構築抗體載體
想利用慢病毒表現系統(Lentivirus expression system)做大量表現
目前實驗室是以transient transfection 表現抗體
載體為pTCAE 含兩個CMV promoter和兩個MCS
如果要以病毒感染方式 用IRES 和用雙CMV會有差別嗎
如果選用IRES 是以 pCMV-LC-IRES-HC 或是 pCMV-HC-IRES-LC 比較好呢
且paper很多IRES的序列 似乎改善的研究還在持續
有前輩用過覺得不錯的IRES序列嗎?
google了相似問題 以下為網路的解答
"IRES效率比較低。 插入目的片段后,IRES後面的報告基因經常看不到熒光
高雙CMV啟動子效率高。兩個CMV啟動子,小心載體內重組。
最好是一個用CMV啟動子,一個用SV40啟動子,或者其它啟動子。"
各位前輩是否認同上述說法呢??
或是可以指引一些paper讓小弟閱讀
不勝感激~~謝謝
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◆ From: 202.169.162.1
1F：推 aceliang:比較常見的是IRES兩端表現量不一。倒不會後面不亮 11/11 19:49
2F：→ aceliang:雙CMV的確有recombinant的風險，比較常見的是雙向promote 11/11 19:50
3F：→ aceliang:像是pBI系列(clontech吧?)。最近流行2A peptide不是？ 11/11 19:50
4F：推 SugarSa:雙向的CMV重組機率會比單向的低嗎 11/11 20:52
謝謝A大的指點 之前有想過要是可以連著做 做完自己會斷成HC LC該有多好
沒想到早就有人做出來了 看來我的資訊update太慢了
看來2A peptide 的確是個不錯的選擇
不過有點疑慮就是抗體前端有signal peptide 不知道2A的殘基會不會影響
另外 小弟有個疑問就是 recombinant是重組去哪啦 就被踢出細胞外了嗎
還是就是在genome間跑來跑去??
如果已經挑到一個產量高的stable clone
recombinant還會經常發生嗎??
※ 編輯: wkj1020 來自: 202.169.162.1 (11/12 10:44)
※ 編輯: wkj1020 來自: 110.27.107.116 (11/14 00:08)
5F：推 aceliang:我不做抗體，所以我不清楚2A peptide殘基影響程度。 11/15 18:37
6F：→ aceliang:不過一般CDS表現上並沒有太大差異。 11/15 18:37
7F：→ aceliang:recombinant常看到的是mutant form，mapping出來完全不對 11/15 18:38
8F：→ aceliang:通常對於repeat seq很多的plasmid我們都會做error rate 11/15 18:39
9F：→ aceliang:transform或streak out下去，挑30-50個colonies來mapping 11/15 18:39
10F：→ aceliang:做出來我個人經驗是bi-directional突變率比較低 11/15 18:40
11F：→ aceliang:2A peptide的運作機制我看過兩種，一說是auto-cleavage 11/15 18:42
12F：→ aceliang:另一說是ribosomal skipping。基於我沒有偵測到過未切斷 11/15 18:43
13F：→ aceliang:的fused protein，所以我猜後者有可能。我猜啦...XD 11/15 18:43