作者wkj1020 (Aj)
看板Biotech
标题[求救] IRES与双CMV promoter
时间Thu Nov 11 17:00:02 2010
小弟目前在构筑抗体载体
想利用慢病毒表现系统(Lentivirus expression system)做大量表现
目前实验室是以transient transfection 表现抗体
载体为pTCAE 含两个CMV promoter和两个MCS
如果要以病毒感染方式 用IRES 和用双CMV会有差别吗
如果选用IRES 是以 pCMV-LC-IRES-HC 或是 pCMV-HC-IRES-LC 比较好呢
且paper很多IRES的序列 似乎改善的研究还在持续
有前辈用过觉得不错的IRES序列吗?
google了相似问题 以下为网路的解答
"IRES效率比较低。 插入目的片段后,IRES後面的报告基因经常看不到荧光
高双CMV启动子效率高。两个CMV启动子,小心载体内重组。
最好是一个用CMV启动子,一个用SV40启动子,或者其它启动子。"
各位前辈是否认同上述说法呢??
或是可以指引一些paper让小弟阅读
不胜感激~~谢谢
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◆ From: 202.169.162.1
1F：推 aceliang:比较常见的是IRES两端表现量不一。倒不会後面不亮 11/11 19:49
2F：→ aceliang:双CMV的确有recombinant的风险，比较常见的是双向promote 11/11 19:50
3F：→ aceliang:像是pBI系列(clontech吧?)。最近流行2A peptide不是？ 11/11 19:50
4F：推 SugarSa:双向的CMV重组机率会比单向的低吗 11/11 20:52
谢谢A大的指点 之前有想过要是可以连着做 做完自己会断成HC LC该有多好
没想到早就有人做出来了 看来我的资讯update太慢了
看来2A peptide 的确是个不错的选择
不过有点疑虑就是抗体前端有signal peptide 不知道2A的残基会不会影响
另外 小弟有个疑问就是 recombinant是重组去哪啦 就被踢出细胞外了吗
还是就是在genome间跑来跑去??
如果已经挑到一个产量高的stable clone
recombinant还会经常发生吗??
※ 编辑: wkj1020 来自: 202.169.162.1 (11/12 10:44)
※ 编辑: wkj1020 来自: 110.27.107.116 (11/14 00:08)
5F：推 aceliang:我不做抗体，所以我不清楚2A peptide残基影响程度。 11/15 18:37
6F：→ aceliang:不过一般CDS表现上并没有太大差异。 11/15 18:37
7F：→ aceliang:recombinant常看到的是mutant form，mapping出来完全不对 11/15 18:38
8F：→ aceliang:通常对於repeat seq很多的plasmid我们都会做error rate 11/15 18:39
9F：→ aceliang:transform或streak out下去，挑30-50个colonies来mapping 11/15 18:39
10F：→ aceliang:做出来我个人经验是bi-directional突变率比较低 11/15 18:40
11F：→ aceliang:2A peptide的运作机制我看过两种，一说是auto-cleavage 11/15 18:42
12F：→ aceliang:另一说是ribosomal skipping。基於我没有侦测到过未切断 11/15 18:43
13F：→ aceliang:的fused protein，所以我猜後者有可能。我猜啦...XD 11/15 18:43