作者keepseaching (絕心忘情)
看板Biotech
標題[求救] Ligation的cutting site接近
時間Wed Nov 3 02:19:43 2010
我在進行的實驗是將一段A基因約1kb
接入pCambia2301這個vector約13kb
所用的cutting site為BamHⅠ與XbaⅠ
所用的條件如下
Insert 10μl
Vector 4μl
bufferA 2μl
bufferB 2μl
Ligase 2μl 4℃反應overnight
做了數次卻接不起來
基本上我的A基因與vector都check過了
所以我在猜想
是否是因為我選用的這兩個cutting site相鄰
導致用酵素切的時候沒辦法兩端都切
不知版上有經驗的版友
有沒有遇過類似的問題
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 218.35.25.28
1F：→ chaunen:網路上似乎也有人用相同的cutting site. 11/03 02:43
2F：→ chaunen:你可能要check一下 vector和inser的濃度. 放個1：10黏看看 11/03 02:44
3F：→ chaunen:如果是益生的ligase system bufferB 似乎是加強blunt end 11/03 02:45
4F：→ chaunen:畢竟size相差有點大.. 11/03 02:47
5F：→ chaunen:所以inser可以考慮多放點... 11/03 02:48
6F：→ chaunen:室溫ligation 2hr, 可以多做一組+0.5ul 10mM ATP 看看 11/03 02:50
7F：→ keepseaching:謝謝 11/03 19:37