作者eatofy (平常心)
看板Biotech
標題[求救] western blot transfer大問題
時間Sat Oct 30 00:29:17 2010
最近跟同學一直在做WB 但卻都一直鬼打牆
我適用 濕轉置 BIO RED系統
transfer buffer使用前都會先滴定ph8.3附近 冰在4度
我夾片的順序是
菜瓜布 濾紙x2 gel membrane 濾紙x2 菜瓜布
定電流400mA 90min on ice
每次都是按造上面的流程
但 詭異的事情來了
當我跟我同學一起轉置的時候 通常兩片gel都會順利轉過
marker清楚的在membrane上
當我一個人只有轉置一片的時候 也都會成功
marker清楚的在membrane上
但是 當我一次轉兩片時 『有時候』 兩片都會成功轉過
但有時候只有一片轉過
另一片會出現marker不在gel, 濾紙或是membrane上＝＝
（都是transfer一結束就馬上取出，不會泡在buffer李太久）
硬著頭皮去壓片 也壓不出什麼東西來 非常的乾淨（actin都沒有）
至於染膠 是還沒用comassive blue染（心力憔悴）
只是真的想不透這到底是什麼問題 會讓這樣的狀況 很隨機的出現
想請問一下大家
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.71.89
1F：→ singren:會不會是電流量不夠?? 1平方公分以25mA算 兩片的話可能電 10/30 00:45
2F：→ singren:流量應該不只需要900mA而已吧~ 10/30 00:46
3F：推 mattmatt:電流不夠或transfer機器有問題 看有沒有接觸不良or沒夾緊 10/30 04:02
4F：→ alulu:該不會是『有時候』其中一片方向放反了...XD 10/30 09:08
5F：→ eatofy:我有每次都有注意 有每有放反耶 應該不是這問題 10/30 18:14
6F：→ eatofy:我們家的POWER定電流最高只到400＝＝ 10/30 18:15
7F：→ eatofy:我跟同學討論也有可能是夾不緊 可是每次感覺都有固定好 10/30 18:16
8F：→ eatofy:但有在考慮下次用橡皮筋 綁起來TRANSFER 10/30 18:17
9F：→ eatofy:不曉得有沒有人用過這個方法 很怕用橡皮筋又出現什麼問題 10/30 18:18
10F：→ chvkimo:有用過象皮筋綁 ok的 10/30 18:45
11F：→ eatofy:這樣就安心一點了 下次來試試 10/30 20:51
12F：推 alaric:您用PVDF membrane? 沒做前處理吧. 10/31 13:01
13F：→ eatofy:有用METH浸泡5MIN 10/31 15:08
14F：推 nymph:buffer我記得pH本來就差不多在8.3附近 而不需要去調 11/01 21:25