作者delta1005 (煌樹)
看板Biotech
標題[求救] real time PCR 不穩定的結果
時間Sun Oct 24 20:05:14 2010
各位大大晚安，希望大家可以幫我一起解決這個問題。
最近我正在做real time PCR，但是結果都不盡理想。
我使用的機型是roach Light Cycler 480，probe 是使用Taq man的系統。每一個sample
我都進行兩重複。
在進行反應時，我在同一個well中同時加入了兩組的primer和probe(reference gene
和target gene，進行standard curve也是同樣)。但是，試了好幾次的結果，通常只有
reference gene的結果是偵測的出來，而且cp值相差不遠，算是好結果。
但是target gene就會呈現偵測不到，或是一個有偵測到，一個沒有。
我想問，為什麼我的實驗結果會這樣，是因為我將兩組的primer和probe混合在一起嗎?
還是有其他原因呢?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.71.85
1F：→ delta1005:抱歉，是Roche 我拼錯了。 10/24 20:08
2F：推 liuse:關鍵詞：混在一起???????? 10/24 20:41
3F：→ delta1005:就在在同一個WELL中，加入兩個基因的primer和probe 10/24 20:54
4F：推 captdavince:你的reference是什麼..該不會是18s rRNA吧.. 10/24 21:13
5F：→ captdavince:沒看清楚.是qRT-PCR還是qPCR而已? 10/24 21:14
6F：→ delta1005:就qPCR，我的reference是 house keeping gene 10/24 21:24
7F：推 yadayada:只做一般的PCR 35 cycles後看的到target gene的產物嗎? 10/24 21:38
8F：→ delta1005:我沒試過一般pcr，不過他的CP值大多落在35之後。 10/24 21:44
9F：推 yadayada:試試增加sample的濃度? 10/24 21:51
10F：推 mattmatt:總cycle數40嗎? 通常cycle數落在30以後線性會比較差 10/25 01:13
11F：→ mattmatt:若你的target比較少 40cy可能不夠偵測 增加10cycle看看 10/25 01:14
12F：→ mattmatt:或是增加template量 35才出來的話可能要增加100倍濃度... 10/25 01:16
13F：→ mattmatt:& 除非sample很珍貴 建議還是不同組分開做比較好 10/25 01:18
14F：→ mattmatt:也有可能pcr條建不適合target那組primer/probe..原因很多 10/25 01:23