作者delta1005 (煌树)
看板Biotech
标题[求救] real time PCR 不稳定的结果
时间Sun Oct 24 20:05:14 2010
各位大大晚安，希望大家可以帮我一起解决这个问题。
最近我正在做real time PCR，但是结果都不尽理想。
我使用的机型是roach Light Cycler 480，probe 是使用Taq man的系统。每一个sample
我都进行两重复。
在进行反应时，我在同一个well中同时加入了两组的primer和probe(reference gene
和target gene，进行standard curve也是同样)。但是，试了好几次的结果，通常只有
reference gene的结果是侦测的出来，而且cp值相差不远，算是好结果。
但是target gene就会呈现侦测不到，或是一个有侦测到，一个没有。
我想问，为什麽我的实验结果会这样，是因为我将两组的primer和probe混合在一起吗?
还是有其他原因呢?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.71.85
1F：→ delta1005:抱歉，是Roche 我拼错了。 10/24 20:08
2F：推 liuse:关键词：混在一起???????? 10/24 20:41
3F：→ delta1005:就在在同一个WELL中，加入两个基因的primer和probe 10/24 20:54
4F：推 captdavince:你的reference是什麽..该不会是18s rRNA吧.. 10/24 21:13
5F：→ captdavince:没看清楚.是qRT-PCR还是qPCR而已? 10/24 21:14
6F：→ delta1005:就qPCR，我的reference是 house keeping gene 10/24 21:24
7F：推 yadayada:只做一般的PCR 35 cycles後看的到target gene的产物吗? 10/24 21:38
8F：→ delta1005:我没试过一般pcr，不过他的CP值大多落在35之後。 10/24 21:44
9F：推 yadayada:试试增加sample的浓度? 10/24 21:51
10F：推 mattmatt:总cycle数40吗? 通常cycle数落在30以後线性会比较差 10/25 01:13
11F：→ mattmatt:若你的target比较少 40cy可能不够侦测 增加10cycle看看 10/25 01:14
12F：→ mattmatt:或是增加template量 35才出来的话可能要增加100倍浓度... 10/25 01:16
13F：→ mattmatt:& 除非sample很珍贵 建议还是不同组分开做比较好 10/25 01:18
14F：→ mattmatt:也有可能pcr条建不适合target那组primer/probe..原因很多 10/25 01:23