作者windyflyer (Windys)
看板Biotech
標題[求救] 長片段ligation>"<
時間Thu Oct 21 13:28:59 2010
有用/ligation爬過文+ligation搜尋Q_Q
我的insert4.7kb, vector9.2kb
insert是PCR後先接到invitrogen的pCR BLUNT vector，總之是個可以接入blunt-end PCR
產物的vector之後再用XbaI切出來，gel elute。
vector則是直接切XbaI後gel elute，不做CIAP。
insert跟vector都處理好後，insert&vector先60度C加熱10分鐘(學姐的紀錄本寫的..)
然後insert跟vector以3:1比例加ligation, 16度C overnight。
之所以不做CIAP是因為只要做了就沒有菌落!!unit是照說明書加的，時間縮短到15分鐘
還是沒有菌落....以往同樣unit條件，30分鐘control就可以降得很低效率也很好..
已經快把各種奇怪條件都試過一遍了還是接不出來>"<而且實驗室中沒人接過這麼長的
片段...
真的很奇怪，作CIAP連個細菌渣都沒看見，不做又長一堆空包彈，我快瘋了!!
懇請各位版友幫幫我Q_Q我已經接了三個月了Orz......
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.174.211
※ 編輯: windyflyer 來自: 163.15.174.211 (10/21 13:29)
1F：推 williamyang:這時候就要推TAKARA的ligation mighty mix~ 10/21 13:56
2F：→ windyflyer:用了也是一樣的結果 所以我才想哭ˊˋ 10/21 13:56
3F：→ williamyang:vector做CIP會比較好,減少background. 10/21 13:57
4F：推 a90648:跟我相同的狀況，用的東西也一樣 我是7k+2k QQ 10/21 14:43
5F：→ a90648:我也是用XbaI切，一樣CIP後就是不會長，沒做的就全部自接 10/21 14:45
剛剛跟學長討論了一下，因為我們實驗室用的CIAP比較特殊(promega)，是先用buffer
dilute過的，要用的時候直接加稀釋的reagent就好，而學長他是都從酵素母管取未稀釋
的ciap，我想今天重新處理vector之後會分一半來重新ciap吧!
都試試看囉....
至少不要連個雜菌都不長給我啊Q_Q" 有菌有希望咩>"< clone恆久遠一顆永留傳啊!!
※ 編輯: windyflyer 來自: 163.15.174.211 (10/21 15:06)
6F：→ genep:請問一下DNA ligase的廠牌? 10/21 17:03
7F：→ windyflyer:EPICENTRE T4 LIGASE 10/21 19:15
8F：推 micocat:vector是XbaI單切嗎 如果是單切的話一定要CIAP 10/21 19:28
9F：→ micocat:不然應該會滿滿都是自接XDD 10/21 19:29
10F：→ windyflyer:現在的問題點就在...一做ciap那個盤就好像中毒了一樣 10/21 19:36
11F：→ windyflyer:連雜菌都不長一顆>"<跟沒塗東西一樣..... 10/21 19:37
我也是CIAP愛用者，我以往成功的且兩邊切位相同的clone都是做CIAP
但現在踢到鐵板，這段clone只要做了CIAP，塗盤的結果就是一顆菌都不長
連雜菌都沒有...整個盤非常乾淨就跟新的一樣= ="
不然人家也想做CIAP呀Q_____Q"
▁
※ 編輯: windyflyer 來自: 163.15.174.211 (10/21 19:40)
12F：→ chaunen:Antarctic Phosphatase 10/21 23:21
13F：推 uouim:前lab在做>15kb時會用電的transformation.. 10/22 14:28
14F：→ windyflyer:我們實驗室只電細胞..沒聽過學長們有用電的= =" 10/22 15:10
15F：→ windyflyer:只聽過電細胞 沒有電細菌=口=" 10/22 15:11
16F：→ ArthurYao:要不要試試別人家的CIP 你以前經驗的CIP 也是promega的? 10/22 15:42
17F：推 mattmatt:我想CIAP還是要做 換Antarctic phosphatase比較好用 10/23 16:58
18F：→ mattmatt:ligation insert給他加到破表(10:1) 溫度4度20小時以上 10/23 16:59
19F：→ mattmatt:vector的話大概總量150ng就夠了... 10/23 17:00
20F：推 yaliu:你的質體總大小有點大耶～會不會其實轉不進去？ 10/24 00:44
21F：→ yaliu:電店的看看效率會不會提昇 10/24 00:44
22F：→ yaliu:有沒有可能在liagtion那一步先確認有沒有黏好，PCR看看？ 10/24 00:45
23F：→ yaliu:用vector的primer PCR看看有沒有黏起來，不過ligation產物通 10/24 00:46
24F：→ yaliu:常不好P....建議濃度可以提昇。加油～ 10/24 00:46
25F：→ yaliu:CIP其實我也建議你做，不然一堆空的也是挑心酸的 10/24 00:47
26F：→ yaliu:不想做CIP的話，就只好換個不一樣的切點囉 10/24 00:49
可是之前學姐有接出來過....確認也都沒問題 我現在是把這段做改造所以要重接
方法是用學姐記錄本寫的方法去做。回ArthurYao, 一樣都是promega的!!
這次有做ciap了,改從新管裡取酵素 不過這次用新的盤抗生素好像太多了(小聲)
只長了一顆 明天看情況再重新處理vector(小小聲)
4度C我也會試試看, 因為學姊的紀錄本裡是有用過但是結果沒有很好, 所以才沒採用..
至於換切點,因為這段一開始是用PCR夾出, 不然根本沒有適合的切位, 如果換切點等於
要重訂primer, 老師會把我宰掉的^^"
至於用電的 實驗室沒有那樣的儀器 學長也叫我先不用考慮 囧"
再次謝謝版友們指教!!目前正在一一試condition中 希望能早日接出來>"<
※ 編輯: windyflyer 來自: 163.15.174.205 (10/24 16:05)
27F：推 icome:gel elute後濃度高嗎 有時候濃度太低會接不進去 10/25 12:38
28F：→ windyflyer:回樓上 濃度夠高唷 band很清楚 10/25 18:06
29F：→ ArthurYao:用cip處理過完全不長 多少會懷疑cip是不是有污染了 XD 10/26 10:34
30F：→ ArthurYao:另外抗生素太多 多放久一點點就可以平衡回來了 XD 10/26 10:34
31F：→ ArthurYao:就我們以前的經驗 大片段對接在ligation的時候會使用 10/26 10:36
32F：→ ArthurYao:低溫4度o/n 然後要transform的時候也會incubation久一點 10/26 10:37
33F：→ ArthurYao:因為大片段比較不好進cell 可以試試看 我是懷疑CIP啦 XD 10/26 10:38
34F：→ windyflyer:cip換掉了~我想看看今天的結果!! 10/27 17:34
35F：→ windyflyer:至於4度C O/N 我會再試一次看看>"<因為上次4度C結果 10/27 17:35
36F：→ windyflyer:control長得比實驗組多... 10/27 17:35
37F：推 mattmatt:↑negative control嗎? nc長太多要check cip反應喔=.=b 10/29 23:35
38F：→ mattmatt:重點是實驗組有長嗎....? 10/29 23:35
39F：→ windyflyer:先回樓上都有長 只是nc長比較多 10/31 23:54
最新戰況!!
今天新塗的盤出來了，negative control沒長...
但是實驗組長出來了呀啊啊啊啊啊~~~~~~晚上已經把菌都挑一挑明天要來抽mini check!
我這次換新的ciap酵素，vector有ciap過，分別在16度跟4度ligate兩天transform，
(然後我就回家拿生活費zzzZZZ)
今天看了收的盤.....control 0顆, 實驗組都有大約20顆~!!
我又額外多做了一組ROCHE的ligation kit本身有自己的ciap酵素,長很多!!大概幾十顆
我預估有到100顆~~
菌養下去了明天看結果!!我很期待>"<如果順利接進去我再把所有的流程仔細po上來!!
非常謝謝這些天來大家的建議,還有人特地站內信or水球>"<
※ 編輯: windyflyer 來自: 111.254.208.93 (11/01 00:03)