作者windyflyer (Windys)
看板Biotech
标题[求救] 长片段ligation>"<
时间Thu Oct 21 13:28:59 2010
有用/ligation爬过文+ligation搜寻Q_Q
我的insert4.7kb, vector9.2kb
insert是PCR後先接到invitrogen的pCR BLUNT vector，总之是个可以接入blunt-end PCR
产物的vector之後再用XbaI切出来，gel elute。
vector则是直接切XbaI後gel elute，不做CIAP。
insert跟vector都处理好後，insert&vector先60度C加热10分钟(学姐的纪录本写的..)
然後insert跟vector以3:1比例加ligation, 16度C overnight。
之所以不做CIAP是因为只要做了就没有菌落!!unit是照说明书加的，时间缩短到15分钟
还是没有菌落....以往同样unit条件，30分钟control就可以降得很低效率也很好..
已经快把各种奇怪条件都试过一遍了还是接不出来>"<而且实验室中没人接过这麽长的
片段...
真的很奇怪，作CIAP连个细菌渣都没看见，不做又长一堆空包弹，我快疯了!!
恳请各位版友帮帮我Q_Q我已经接了三个月了Orz......
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.174.211
※ 编辑: windyflyer 来自: 163.15.174.211 (10/21 13:29)
1F：推 williamyang:这时候就要推TAKARA的ligation mighty mix~ 10/21 13:56
2F：→ windyflyer:用了也是一样的结果 所以我才想哭ˊˋ 10/21 13:56
3F：→ williamyang:vector做CIP会比较好,减少background. 10/21 13:57
4F：推 a90648:跟我相同的状况，用的东西也一样 我是7k+2k QQ 10/21 14:43
5F：→ a90648:我也是用XbaI切，一样CIP後就是不会长，没做的就全部自接 10/21 14:45
刚刚跟学长讨论了一下，因为我们实验室用的CIAP比较特殊(promega)，是先用buffer
dilute过的，要用的时候直接加稀释的reagent就好，而学长他是都从酵素母管取未稀释
的ciap，我想今天重新处理vector之後会分一半来重新ciap吧!
都试试看罗....
至少不要连个杂菌都不长给我啊Q_Q" 有菌有希望咩>"< clone恒久远一颗永留传啊!!
※ 编辑: windyflyer 来自: 163.15.174.211 (10/21 15:06)
6F：→ genep:请问一下DNA ligase的厂牌? 10/21 17:03
7F：→ windyflyer:EPICENTRE T4 LIGASE 10/21 19:15
8F：推 micocat:vector是XbaI单切吗 如果是单切的话一定要CIAP 10/21 19:28
9F：→ micocat:不然应该会满满都是自接XDD 10/21 19:29
10F：→ windyflyer:现在的问题点就在...一做ciap那个盘就好像中毒了一样 10/21 19:36
11F：→ windyflyer:连杂菌都不长一颗>"<跟没涂东西一样..... 10/21 19:37
我也是CIAP爱用者，我以往成功的且两边切位相同的clone都是做CIAP
但现在踢到铁板，这段clone只要做了CIAP，涂盘的结果就是一颗菌都不长
连杂菌都没有...整个盘非常乾净就跟新的一样= ="
不然人家也想做CIAP呀Q_____Q"
▁
※ 编辑: windyflyer 来自: 163.15.174.211 (10/21 19:40)
12F：→ chaunen:Antarctic Phosphatase 10/21 23:21
13F：推 uouim:前lab在做>15kb时会用电的transformation.. 10/22 14:28
14F：→ windyflyer:我们实验室只电细胞..没听过学长们有用电的= =" 10/22 15:10
15F：→ windyflyer:只听过电细胞 没有电细菌=口=" 10/22 15:11
16F：→ ArthurYao:要不要试试别人家的CIP 你以前经验的CIP 也是promega的? 10/22 15:42
17F：推 mattmatt:我想CIAP还是要做 换Antarctic phosphatase比较好用 10/23 16:58
18F：→ mattmatt:ligation insert给他加到破表(10:1) 温度4度20小时以上 10/23 16:59
19F：→ mattmatt:vector的话大概总量150ng就够了... 10/23 17:00
20F：推 yaliu:你的质体总大小有点大耶～会不会其实转不进去？ 10/24 00:44
21F：→ yaliu:电店的看看效率会不会提昇 10/24 00:44
22F：→ yaliu:有没有可能在liagtion那一步先确认有没有黏好，PCR看看？ 10/24 00:45
23F：→ yaliu:用vector的primer PCR看看有没有黏起来，不过ligation产物通 10/24 00:46
24F：→ yaliu:常不好P....建议浓度可以提昇。加油～ 10/24 00:46
25F：→ yaliu:CIP其实我也建议你做，不然一堆空的也是挑心酸的 10/24 00:47
26F：→ yaliu:不想做CIP的话，就只好换个不一样的切点罗 10/24 00:49
可是之前学姐有接出来过....确认也都没问题 我现在是把这段做改造所以要重接
方法是用学姐记录本写的方法去做。回ArthurYao, 一样都是promega的!!
这次有做ciap了,改从新管里取酵素 不过这次用新的盘抗生素好像太多了(小声)
只长了一颗 明天看情况再重新处理vector(小小声)
4度C我也会试试看, 因为学姊的纪录本里是有用过但是结果没有很好, 所以才没采用..
至於换切点,因为这段一开始是用PCR夹出, 不然根本没有适合的切位, 如果换切点等於
要重订primer, 老师会把我宰掉的^^"
至於用电的 实验室没有那样的仪器 学长也叫我先不用考虑 囧"
再次谢谢版友们指教!!目前正在一一试condition中 希望能早日接出来>"<
※ 编辑: windyflyer 来自: 163.15.174.205 (10/24 16:05)
27F：推 icome:gel elute後浓度高吗 有时候浓度太低会接不进去 10/25 12:38
28F：→ windyflyer:回楼上 浓度够高唷 band很清楚 10/25 18:06
29F：→ ArthurYao:用cip处理过完全不长 多少会怀疑cip是不是有污染了 XD 10/26 10:34
30F：→ ArthurYao:另外抗生素太多 多放久一点点就可以平衡回来了 XD 10/26 10:34
31F：→ ArthurYao:就我们以前的经验 大片段对接在ligation的时候会使用 10/26 10:36
32F：→ ArthurYao:低温4度o/n 然後要transform的时候也会incubation久一点 10/26 10:37
33F：→ ArthurYao:因为大片段比较不好进cell 可以试试看 我是怀疑CIP啦 XD 10/26 10:38
34F：→ windyflyer:cip换掉了~我想看看今天的结果!! 10/27 17:34
35F：→ windyflyer:至於4度C O/N 我会再试一次看看>"<因为上次4度C结果 10/27 17:35
36F：→ windyflyer:control长得比实验组多... 10/27 17:35
37F：推 mattmatt:↑negative control吗? nc长太多要check cip反应喔=.=b 10/29 23:35
38F：→ mattmatt:重点是实验组有长吗....? 10/29 23:35
39F：→ windyflyer:先回楼上都有长 只是nc长比较多 10/31 23:54
最新战况!!
今天新涂的盘出来了，negative control没长...
但是实验组长出来了呀啊啊啊啊啊~~~~~~晚上已经把菌都挑一挑明天要来抽mini check!
我这次换新的ciap酵素，vector有ciap过，分别在16度跟4度ligate两天transform，
(然後我就回家拿生活费zzzZZZ)
今天看了收的盘.....control 0颗, 实验组都有大约20颗~!!
我又额外多做了一组ROCHE的ligation kit本身有自己的ciap酵素,长很多!!大概几十颗
我预估有到100颗~~
菌养下去了明天看结果!!我很期待>"<如果顺利接进去我再把所有的流程仔细po上来!!
非常谢谢这些天来大家的建议,还有人特地站内信or水球>"<
※ 编辑: windyflyer 来自: 111.254.208.93 (11/01 00:03)