作者giooy ()
站內Biotech
標題[求救] E. coli蛋白質表現
時間Wed Oct 13 23:10:41 2010
各位高手好，小弟想請教幾個問題
我現在用E. coli BL-21這支expression host表現plasmid pET-28a
使用IPTG-induction，因為實驗室沒有人做過我insert的基因的相關資料
所以養到O.D.=0.4~0.6時加入IPTG，大概培養多久時間收?
第二個問題是現在不知道蛋白質表現會在細胞哪個部位?
不太可能是胞外蛋白，有可能是胞內可溶性或inclusion body或membrane protein
我想先把表現完的菌液先離心，上清留存，pellet回溶，但是不知道用哪種buffer?
接下來應該是一步一步離心，收pellet和supernatant
詳細的步驟請教有經驗的高手，拜託大家了，感謝!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 111.249.183.206
1F：推 tsubasawolfy:read the pET manual book plz 10/13 23:48
2F：推 TOTO:你是該看看手冊,另每種蛋白質性質歧異很大,表達參數也差很大 10/14 02:14
3F：→ TOTO:你得自己在這邊做功課去找你的蛋白最佳解,別人給不了答案的 10/14 02:14
4F：→ biingru:你是用 BL21 還是 BL21(DE3)? 10/14 09:48
5F：推 hangzer:這種表現蛋白質的問題應該要自己是條件 別人用的條件不一 10/14 15:51
6F：→ hangzer:定適合你的蛋白質 可以看你們實驗室之前用的條件 自己再慢 10/14 15:52
7F：→ hangzer:改 10/14 15:52
8F：→ yuka16830:molecular cloning可以參考看看 有測試條件的protocol 10/17 11:14
9F：推 alaric:1.請做對照組比較, 2.最適反應條件自己抓, 可參考別人的. 10/19 04:16
10F：→ alaric:3.請把你構築的目的看懂, 還有你的合成蛋白有無Target Seq. 10/19 04:17