作者pent (情人去死)
看板Biotech
標題Re: [求救] 抽大量plasmid，isopropanol沈澱後看不 …
時間Wed Sep 29 22:01:41 2010
再次求救，偶爾有抽到，但是最近又開始抽不到了，唉。
我抽midi，一樣follow qiagen midi protocol，
只是我菌養超多，500ml，分兩支column，
中間有照它的建議，保留一些sample下來，
今天最後又抽失敗了，還特別跟別人借了一組midi column和全部的buffer，
在他們實驗室確定是能正常working的，
因為我家的buffer也不知道放多久了，
但最後發現，
1. 我第一次wash的部份就有plasmid (收400ul isopropanol沈澱)
2. 但我elution的部份沒看到，(收100ul，isopropanol沈澱)
我最後isopropanol的沈澱也沒看到
根據，protocol上的說法，
第一次wash有，可能是我養過多的關係，
但是，我的elution又沒有，
能不能幫我想想可能的問題在哪或者我該怎樣做呢？
過多的菌液，應該不會連最後的elution都沒有吧？
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.60
1F：→ pent:因為之前有陣子抽不出來，是搖300ml的菌卻分成兩支column，so 09/29 22:04
2F：→ pent:現在都故意養超多，反正頂多只是流掉，但希望能把column充分 09/29 22:05
3F：→ pent:使用 09/29 22:05
4F：推 aggaci:加isopropanol後凍在-80 o/n再離心 09/29 22:49
5F：→ pent:有試過，看不見白白的pellet，是代表沒有嗎? 09/29 23:59
6F：推 icome:照你的描述應該是kit有問題 整個kit退回去換新的 09/30 11:28
7F：推 iceking:第一,你的菌太多,菌太多Lysis不完全,影響產量. 09/30 13:45
8F：推 iceking:第二,wash buffer可能放太久了,換掉~ 不然用75%酒精wash 09/30 14:02
9F：→ iceking:第三,elution buffer可以加熱,增加質體溶解度 09/30 14:03
10F：推 iceking:最後問一下,你怎麼判定有沒有plasmid,你有測濃度嗎? 09/30 14:06
11F：推 tin0101:菌太多~就是正解 09/30 20:34
12F：推 silentence:midi抽不到大多是菌太多 Lysis buffer用多點+作用久 10/03 02:42
13F：→ silentence:一點 10/03 02:42
14F：→ bossjoe:請問你Isopropanol加多少?之前遇過同樣問題!! 10/07 11:35
15F：→ bossjoe:後來調高iso的量，就成功了!這是小弟個人淺見!! 10/07 11:36
16F：→ chaunen:如果buffer123加完離心後通column, 滴出來的液體有plasmid 10/08 01:36
17F：→ chaunen:表示菌太多 or column壞了(一般而言還不太可能壞) 10/08 01:36
18F：→ chaunen:若只有wash時才有東西, 可能是EtOH濃度不夠了吧 10/08 01:37
19F：→ chaunen:可以根據quiagen的手冊配新的即可 10/08 01:37