作者pent (情人去死)
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标题Re: [求救] 抽大量plasmid，isopropanol沈淀後看不 …
时间Wed Sep 29 22:01:41 2010
再次求救，偶尔有抽到，但是最近又开始抽不到了，唉。
我抽midi，一样follow qiagen midi protocol，
只是我菌养超多，500ml，分两支column，
中间有照它的建议，保留一些sample下来，
今天最後又抽失败了，还特别跟别人借了一组midi column和全部的buffer，
在他们实验室确定是能正常working的，
因为我家的buffer也不知道放多久了，
但最後发现，
1. 我第一次wash的部份就有plasmid (收400ul isopropanol沈淀)
2. 但我elution的部份没看到，(收100ul，isopropanol沈淀)
我最後isopropanol的沈淀也没看到
根据，protocol上的说法，
第一次wash有，可能是我养过多的关系，
但是，我的elution又没有，
能不能帮我想想可能的问题在哪或者我该怎样做呢？
过多的菌液，应该不会连最後的elution都没有吧？
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.60
1F：→ pent:因为之前有阵子抽不出来，是摇300ml的菌却分成两支column，so 09/29 22:04
2F：→ pent:现在都故意养超多，反正顶多只是流掉，但希望能把column充分 09/29 22:05
3F：→ pent:使用 09/29 22:05
4F：推 aggaci:加isopropanol後冻在-80 o/n再离心 09/29 22:49
5F：→ pent:有试过，看不见白白的pellet，是代表没有吗? 09/29 23:59
6F：推 icome:照你的描述应该是kit有问题 整个kit退回去换新的 09/30 11:28
7F：推 iceking:第一,你的菌太多,菌太多Lysis不完全,影响产量. 09/30 13:45
8F：推 iceking:第二,wash buffer可能放太久了,换掉~ 不然用75%酒精wash 09/30 14:02
9F：→ iceking:第三,elution buffer可以加热,增加质体溶解度 09/30 14:03
10F：推 iceking:最後问一下,你怎麽判定有没有plasmid,你有测浓度吗? 09/30 14:06
11F：推 tin0101:菌太多~就是正解 09/30 20:34
12F：推 silentence:midi抽不到大多是菌太多 Lysis buffer用多点+作用久 10/03 02:42
13F：→ silentence:一点 10/03 02:42
14F：→ bossjoe:请问你Isopropanol加多少?之前遇过同样问题!! 10/07 11:35
15F：→ bossjoe:後来调高iso的量，就成功了!这是小弟个人浅见!! 10/07 11:36
16F：→ chaunen:如果buffer123加完离心後通column, 滴出来的液体有plasmid 10/08 01:36
17F：→ chaunen:表示菌太多 or column坏了(一般而言还不太可能坏) 10/08 01:36
18F：→ chaunen:若只有wash时才有东西, 可能是EtOH浓度不够了吧 10/08 01:37
19F：→ chaunen:可以根据quiagen的手册配新的即可 10/08 01:37