作者JuneTiger (JuneTiger)
看板Biotech
標題[求救] clone不出來
時間Sat Sep 25 22:39:07 2010
2.8K這段我已經有成功接在pGEX上
但是要把他再接進去flag
卻一直接不出來 希望大家可以給我一點建議
我實驗的步驟在下面 希望大家可以幫我看看問題出在哪...
1) PCR
10X buffer 2.5
dNTPs 0.5
Primer-R 0.5
Primer-F 0.5
DNA polymerase(pfu)0.5
DMSO 1.5
ddH2O 18
->clean up->跑膠(跑起來是single band)
2) 切RE
buffer 3 5 ul buffer3 5ul
PCR product 15 ul flag(midi) 1ul
NotI 1.5 ul NotI 1.5ul
SalI-HF 1.5 ul SalI-HF 1.5ul
100X BSA 0.5 ul 100x BSA 0.5ul
ddH2O 26.5 ul ddH2O 40.5ul
作用37度，3小時 -> clean up ->跑電泳
3) ligation
vector 4 ul
DNA 8 ul
T4 ligase 1 ul
ATP 1 ul
buffer 2 ul
ddH2O 4 ul
4) Tansformation(DH5alpha):
on ice 30min
HEAT-SHOCK 42度 90sec
on ice 2min
LB培養 3hr
塗盤(LB agar Amp) O/N
(菌落都沒有長的很大，比較大的約只有0.1cm，大的很少，一盤大約只有10顆以內
很多超小的菌落，不太像衛星，因為是很均勻分布在整個盤子上，應該有幾百顆 )
5)colony PCR
很小的跟大顆的都有P，都沒有P到我要的東西，但是有P到很多條band
P.s有拿空的flag做transform，但是長出來的也是很小的菌落，滿滿的一盤
不知道是不是因為塗盤的時候下太多了?!
希望大家可以幫我指點迷津
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.47.66.228
1F：→ Rarelay:你的 lagation 應該要寫 insert 跟 vector 的濃度 09/25 23:25
2F：→ chaunen:flag的vector是lenti的嗎? 09/25 23:32
3F：→ nerdz:我沒誤會的話你給的全是體積單位..有意義嗎 09/25 23:41
4F：→ JuneTiger:沒有測inser跟vector的濃度耶@@ 跑完膠亮度大約是1:2 09/25 23:54
5F：→ JuneTiger:flag不是lenti 09/26 00:15
6F：推 FENOR:你的問題是不是要再那個2.8K的gene前或後端接上flag 09/26 15:18
7F：→ FENOR:如果是的話，當初我也做過類似的東西，不過我用的是類似 09/26 15:19
8F：→ FENOR:做shRNA的方法，先訂兩條primer，接著讓他們在高濃度下黏合 09/26 15:19
9F：→ FENOR:最後黏合出來的產物跟已經切好的PCR product一樣，再將其 09/26 15:20
10F：→ FENOR:接入。 09/26 15:20
11F：推 aggaci:樓上的方法的primer要先磷酸化，或是黏好的產物要再磷酸化 09/26 21:50