作者JuneTiger (JuneTiger)
看板Biotech
标题[求救] clone不出来
时间Sat Sep 25 22:39:07 2010
2.8K这段我已经有成功接在pGEX上
但是要把他再接进去flag
却一直接不出来 希望大家可以给我一点建议
我实验的步骤在下面 希望大家可以帮我看看问题出在哪...
1) PCR
10X buffer 2.5
dNTPs 0.5
Primer-R 0.5
Primer-F 0.5
DNA polymerase(pfu)0.5
DMSO 1.5
ddH2O 18
->clean up->跑胶(跑起来是single band)
2) 切RE
buffer 3 5 ul buffer3 5ul
PCR product 15 ul flag(midi) 1ul
NotI 1.5 ul NotI 1.5ul
SalI-HF 1.5 ul SalI-HF 1.5ul
100X BSA 0.5 ul 100x BSA 0.5ul
ddH2O 26.5 ul ddH2O 40.5ul
作用37度，3小时 -> clean up ->跑电泳
3) ligation
vector 4 ul
DNA 8 ul
T4 ligase 1 ul
ATP 1 ul
buffer 2 ul
ddH2O 4 ul
4) Tansformation(DH5alpha):
on ice 30min
HEAT-SHOCK 42度 90sec
on ice 2min
LB培养 3hr
涂盘(LB agar Amp) O/N
(菌落都没有长的很大，比较大的约只有0.1cm，大的很少，一盘大约只有10颗以内
很多超小的菌落，不太像卫星，因为是很均匀分布在整个盘子上，应该有几百颗 )
5)colony PCR
很小的跟大颗的都有P，都没有P到我要的东西，但是有P到很多条band
P.s有拿空的flag做transform，但是长出来的也是很小的菌落，满满的一盘
不知道是不是因为涂盘的时候下太多了?!
希望大家可以帮我指点迷津
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.47.66.228
1F：→ Rarelay:你的 lagation 应该要写 insert 跟 vector 的浓度 09/25 23:25
2F：→ chaunen:flag的vector是lenti的吗? 09/25 23:32
3F：→ nerdz:我没误会的话你给的全是体积单位..有意义吗 09/25 23:41
4F：→ JuneTiger:没有测inser跟vector的浓度耶@@ 跑完胶亮度大约是1:2 09/25 23:54
5F：→ JuneTiger:flag不是lenti 09/26 00:15
6F：推 FENOR:你的问题是不是要再那个2.8K的gene前或後端接上flag 09/26 15:18
7F：→ FENOR:如果是的话，当初我也做过类似的东西，不过我用的是类似 09/26 15:19
8F：→ FENOR:做shRNA的方法，先订两条primer，接着让他们在高浓度下黏合 09/26 15:19
9F：→ FENOR:最後黏合出来的产物跟已经切好的PCR product一样，再将其 09/26 15:20
10F：→ FENOR:接入。 09/26 15:20
11F：推 aggaci:楼上的方法的primer要先磷酸化，或是黏好的产物要再磷酸化 09/26 21:50