作者sunday30430 (koalawoman)
看板Biotech
標題[求救] 請幫我檢視抽RNA的流程!
時間Sat Sep 11 16:05:52 2010
昨天我以為我改了很多地方應該會成功，但我還是失敗了，我決定打一下流程，請大家幫
我解惑和檢視
收菌:昨天我以為我已經改了很多部分應該會成功，但今天狀況一樣糟，我決定來打一下流程
收菌:
菌液+MEDIUM+藥混合養DISH裡6小時，把細菌刮下來收在eppendorf裡→離心→去上清液→
再pellet裡加入1XPBS IN DEPC-H2O→冰-80冰箱
(這樣做細菌不會破裂嗎?我以前做細胞都是用抗凍劑，細菌也需要嗎?)
抽RNA:(抽完的RNA代號x，要不然之後會看得霧煞煞)
將昨天凍的菌拿出來解凍放冰上，加入200ul lysozyme+10ul lysostaphin作用兩個小時
大概每15分鐘會去翻轉eppendorf，之後用geneaid的Total RNA Mini Kit 是照廠商的
protocol(網址:
http://www.geneaid.com/products_content/33/100/ )操作，可是沒
在冰上在室溫，抽完之後取7ul出來用nanodorp測RNA含量
結果很可怕:
A RNA含量 260/280
222.9 2.26
219.5 2.03
230.1 2.18
B 22.4 2
22.3 2.03
22.1 1.94
我是想要拿1ug去RT但現在這樣就已經品質不好了，所以之後的流程就沒再做下去!
針對今天的可怕結果，我去問對面實驗室的學長，他覺得沒滅菌就已經是個大問題，
另外，他說操作KIT時也要在冰上，離心機一定要預冷4度c(我是在室溫)，還要把kit裡的
buffer們拿去預冷，這是他給我的建議，所以我現在把器具趁老闆不再拿去滅。明天照他
的建議在做一次!
之後的流程也請大家幫我看一下是否有問題?
dnaes treat :
總體積10ul
10x buffer 1ul
dnase 2ul
RNA取1ug的量
剩下用DEPC-H2O去補
37度C 1小時→加入1ul stop solution→65度C 10分鐘
目前為止體積是11ul,取1ul出來之後會用(把這1ul代號Y)
reverse transcription:
上個步驟剩的 10ul
2.5mM dNTP 5ul
random hexamer 0.5ul
混合→65度C 10分鐘→冰上兩分鐘→繼續加入
RNA inhibitor 1ul
5xbuffer 5ul
MMLV 2ul
DEPC-H2O 1.5ul
以PCR機器去RT
25度 10分鐘→42度c 90分鐘 →95度c 5分鐘 →保存在4度
RT完的產物(Z)
PCR的部分有點複雜
template 1ul 也就是把xyz各取1ul出來
25mM dNTP 1ul
10mM F-primer 2ul
10mM R-primer 2ul
10xbuffer 2ul
2.5mM tag 0.3ul
ddH2O 11.7ul
去跑PCR→Agarose gel→染EtBr
之前的結果也很可怕:
x(RNA) 有band
y(DNase treat RNA) 有淡淡的band 跟X再相同位置→不應該有
Z(cDNA)沒有band→應該要有
請幫我看一下，感謝!!!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.94.144
1F：推 onlyone0419:你是在冰上操作嗎? 09/11 18:08
2F：→ chaunen:以做細胞的來說（抱歉我沒做過細菌）先倒掉medium 09/11 18:10
3F：→ chaunen:用ice PBS wash 2次後, 直接加入抽RNA的reagent 刮細胞 09/11 18:11
4F：→ chaunen:整個過程冷凍次數愈少愈好 09/11 18:12
5F：→ chaunen:另外, Dnase也會殺掉近乎一半的RNA, 09/11 18:13
6F：→ chaunen:不管抽出來濃度 ratio如何 先跑張1% agarose gel 09/11 18:16
7F：推 onlyone0419:這加抽DNA的KIT我用過不錯，RNA的我就不曉得了@@ 09/11 18:19
8F：→ chaunen:看看RNA degrade的程度吧（16s 23s rRNA??） 09/11 18:22
9F：→ chaunen:去除DNA污染可以用AluI這個酵素（只切雙股DNA） 09/11 18:29
10F：→ chaunen:PROTOCOL 你可能要自行上網搜尋 09/11 18:29
11F：→ chaunen:geneaid protocol上破菌好像沒那麼久？ 09/11 18:38
12F：→ sunday30430:破菌的部份，跟KIT不一樣，我從廠商的STEP2開始，因為 09/11 18:58
13F：→ sunday30430:老闆說菌的關係! 09/11 19:00
14F：→ sunday30430:我只有在破菌是再冰上，其他是在常溫，所以全程都應該 09/11 19:01
15F：→ sunday30430:在冰上是嗎??? 09/11 19:01
16F：→ chaunen:破菌的時候,RNase就會跑出來（別人的paper也是這樣做嗎?） 09/11 19:10
17F：→ chaunen:盡量全程on ice 09/11 19:11
18F：→ sunday30430:破菌的方法是跟別的實驗室問的! 09/11 20:50
19F：→ chaunen:同樣這隻菌? 09/11 21:43
20F：→ sunday30430:對!是一樣的菌! 09/11 21:48
21F：推 captdavince:我有個問題..為何收菌後不現抽呢? 09/12 00:25
22F：推 huhu126:如果要用kit抽,就不用前面冷凍及lysozyme破菌的動作了, 09/12 00:26
23F：→ huhu126:如c大所言,直接抽反而更好,kit如果沒強調一定要在低溫或是 09/12 00:29
24F：→ huhu126:不要,那是否全程冰上應該沒差,只有最後回溶離心後要低溫, 09/12 00:30
25F：→ huhu126:另外,別兼實驗室如果操作這隻菌沒問題,是否可以請老闆讓你 09/12 00:31
26F：→ huhu126:過去見習一下別人如何做?確實一破菌RNase就出來了,所以一 09/12 00:33
27F：→ huhu126:般可在此步驟加proteinase K.另外,我覺得破菌時間真的有點 09/12 00:35
28F：→ huhu126:久. 不過不太懂 RNA A及B差別為何? A明明有且純?? 09/12 00:37
29F：推 huhu126:nanodrop可直接測出ng/ul,用1.5ul去測即可吧?7ul不心疼嗎? 09/12 00:41
30F：推 yaliu:如果別間實驗室用同樣kit抽的出來，我覺得你還是去看一下他 09/12 00:47
31F：→ yaliu:們是如何操作的...不然我覺得傳統trizol就很好抽了 09/12 00:48
32F：→ yaliu:步驟也沒這麼多～但其實我們都會盡量全程冰上操作 09/12 00:49
33F：→ yaliu:然後我也覺得lysozyme處理有點久耶～這株菌這麼難破壁嗎 09/12 00:51
34F：推 mattmatt:lysozyme真的處理有點久..破菌後RNase就放出來了 09/12 03:45
35F：→ mattmatt:RNA 15分鐘就會被吃光.試試別的破菌法? 超音波.冷凍解凍. 09/12 03:46
36F：→ mattmatt:另外kit多少會有dna殘留 原核的話還是dnase一下比較保險 09/12 03:50
37F：→ mattmatt:Dnase inactive建議用PCI/CI 65度C下Rnase活性會出來 09/12 03:52
38F：→ mattmatt:你說dnase完RT還會有band 這有點怪...dnase是哪一牌的阿? 09/12 03:57
39F：→ mattmatt:最後RT完沒有band...這原因就很多了.. 09/12 03:58
40F：→ mattmatt:不知有沒有RNA抽完直接跑膠的圖可以看一下? 09/12 03:59
41F：→ sunday30430:見習這事我有跟老闆說過，但沒下文，我也很無法，至於 09/12 11:13
42F：→ sunday30430:7ul則因為我測三次啦!，老闆說要三次平均! 09/12 11:13
43F：→ sunday30430:破菌的時間和方法是老闆跟對面問的，對面做最好的一次 09/12 11:15
44F：→ sunday30430:是同樣方法且時間更久! 09/12 11:16
45F：→ sunday30430:我不知道DNase是哪個牌子，我今天會去看一下! 09/12 11:23
46F：→ sunday30430:因為收菌前還有PRTREAT一些東西，但我下次會直接收完 09/12 11:32
47F：→ sunday30430:就抽! 09/12 11:32
48F：→ sunday30430:mattmatt:意思是我在DNasetreat時，會讓rnase活化是嗎 09/12 11:48
49F：推 mattmatt:一般用kit或傳統方法甚至trizol純化 多少會有rnase殘留 09/12 19:22
50F：→ mattmatt:這應該大家都可認同,在dnase處理時會加rnase inhibitor 09/12 19:23
51F：→ mattmatt:這種情況在37度反應下 rnase活性似乎沒有這麼高 09/12 19:24
52F：→ mattmatt:但在65度下 rnase活性似乎會很強 (不知道是哪隻rnase) 09/12 19:24
53F：→ mattmatt:之前做測試 不管是否加入dnase或dnase inhibit solution 09/12 19:26
54F：→ mattmatt:RNA都會嚴重degrade 但手上沒有"真正純"的RNA 09/12 19:27
55F：→ mattmatt:所以很難證明究竟是RNase在65度下活性大增 09/12 19:27
56F：→ mattmatt:還是說RNA在65度下會degreade (已排除dnase或buffer汙染) 09/12 19:28
57F：→ mattmatt:RT時也有一步將RNA加熱至65度 姑且相信65度不會使RNA分解 09/12 19:30
58F：→ mattmatt:只能推測RNase於65度活性增強(印象有看過國外討論有提到) 09/12 19:31
59F：推 mattmatt:最後還是用PCI/CI 管他有RNase DNase 一次清光光就沒問題 09/12 19:34
60F：→ mattmatt:另外 從此之後抽RNA都沒刻意放在冰上 一般室溫操作都沒事 09/12 19:34
61F：→ mattmatt:經過純化後在室溫下 RNase活性沒有想像中的強 so... 09/12 19:37
62F：→ mattmatt:上面這句違反正道...為求保險 好孩子不要學XD 09/12 19:38
63F：推 yaliu:跟對面實驗室打好關係～他們在抽的時候就過去看一下就好了XD 09/14 00:54
64F：→ left873:Staph破菌是關鍵 試試加完enzymes後37度C 15-20分鐘再抽 09/15 09:15
65F：→ sunday30430:結果是KIT的問題，因為傳統法有做出來! 09/17 09:07
66F：推 leoblack:要廠商退錢!!!! 09/17 12:09