作者sunday30430 (koalawoman)
看板Biotech
标题[求救] 请帮我检视抽RNA的流程!
时间Sat Sep 11 16:05:52 2010
昨天我以为我改了很多地方应该会成功，但我还是失败了，我决定打一下流程，请大家帮
我解惑和检视
收菌:昨天我以为我已经改了很多部分应该会成功，但今天状况一样糟，我决定来打一下流程
收菌:
菌液+MEDIUM+药混合养DISH里6小时，把细菌刮下来收在eppendorf里→离心→去上清液→
再pellet里加入1XPBS IN DEPC-H2O→冰-80冰箱
(这样做细菌不会破裂吗?我以前做细胞都是用抗冻剂，细菌也需要吗?)
抽RNA:(抽完的RNA代号x，要不然之後会看得雾煞煞)
将昨天冻的菌拿出来解冻放冰上，加入200ul lysozyme+10ul lysostaphin作用两个小时
大概每15分钟会去翻转eppendorf，之後用geneaid的Total RNA Mini Kit 是照厂商的
protocol(网址:
http://www.geneaid.com/products_content/33/100/ )操作，可是没
在冰上在室温，抽完之後取7ul出来用nanodorp测RNA含量
结果很可怕:
A RNA含量 260/280
222.9 2.26
219.5 2.03
230.1 2.18
B 22.4 2
22.3 2.03
22.1 1.94
我是想要拿1ug去RT但现在这样就已经品质不好了，所以之後的流程就没再做下去!
针对今天的可怕结果，我去问对面实验室的学长，他觉得没灭菌就已经是个大问题，
另外，他说操作KIT时也要在冰上，离心机一定要预冷4度c(我是在室温)，还要把kit里的
buffer们拿去预冷，这是他给我的建议，所以我现在把器具趁老板不再拿去灭。明天照他
的建议在做一次!
之後的流程也请大家帮我看一下是否有问题?
dnaes treat :
总体积10ul
10x buffer 1ul
dnase 2ul
RNA取1ug的量
剩下用DEPC-H2O去补
37度C 1小时→加入1ul stop solution→65度C 10分钟
目前为止体积是11ul,取1ul出来之後会用(把这1ul代号Y)
reverse transcription:
上个步骤剩的 10ul
2.5mM dNTP 5ul
random hexamer 0.5ul
混合→65度C 10分钟→冰上两分钟→继续加入
RNA inhibitor 1ul
5xbuffer 5ul
MMLV 2ul
DEPC-H2O 1.5ul
以PCR机器去RT
25度 10分钟→42度c 90分钟 →95度c 5分钟 →保存在4度
RT完的产物(Z)
PCR的部分有点复杂
template 1ul 也就是把xyz各取1ul出来
25mM dNTP 1ul
10mM F-primer 2ul
10mM R-primer 2ul
10xbuffer 2ul
2.5mM tag 0.3ul
ddH2O 11.7ul
去跑PCR→Agarose gel→染EtBr
之前的结果也很可怕:
x(RNA) 有band
y(DNase treat RNA) 有淡淡的band 跟X再相同位置→不应该有
Z(cDNA)没有band→应该要有
请帮我看一下，感谢!!!!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.94.144
1F：推 onlyone0419:你是在冰上操作吗? 09/11 18:08
2F：→ chaunen:以做细胞的来说（抱歉我没做过细菌）先倒掉medium 09/11 18:10
3F：→ chaunen:用ice PBS wash 2次後, 直接加入抽RNA的reagent 刮细胞 09/11 18:11
4F：→ chaunen:整个过程冷冻次数愈少愈好 09/11 18:12
5F：→ chaunen:另外, Dnase也会杀掉近乎一半的RNA, 09/11 18:13
6F：→ chaunen:不管抽出来浓度 ratio如何 先跑张1% agarose gel 09/11 18:16
7F：推 onlyone0419:这加抽DNA的KIT我用过不错，RNA的我就不晓得了@@ 09/11 18:19
8F：→ chaunen:看看RNA degrade的程度吧（16s 23s rRNA??） 09/11 18:22
9F：→ chaunen:去除DNA污染可以用AluI这个酵素（只切双股DNA） 09/11 18:29
10F：→ chaunen:PROTOCOL 你可能要自行上网搜寻 09/11 18:29
11F：→ chaunen:geneaid protocol上破菌好像没那麽久？ 09/11 18:38
12F：→ sunday30430:破菌的部份，跟KIT不一样，我从厂商的STEP2开始，因为 09/11 18:58
13F：→ sunday30430:老板说菌的关系! 09/11 19:00
14F：→ sunday30430:我只有在破菌是再冰上，其他是在常温，所以全程都应该 09/11 19:01
15F：→ sunday30430:在冰上是吗??? 09/11 19:01
16F：→ chaunen:破菌的时候,RNase就会跑出来（别人的paper也是这样做吗?） 09/11 19:10
17F：→ chaunen:尽量全程on ice 09/11 19:11
18F：→ sunday30430:破菌的方法是跟别的实验室问的! 09/11 20:50
19F：→ chaunen:同样这只菌? 09/11 21:43
20F：→ sunday30430:对!是一样的菌! 09/11 21:48
21F：推 captdavince:我有个问题..为何收菌後不现抽呢? 09/12 00:25
22F：推 huhu126:如果要用kit抽,就不用前面冷冻及lysozyme破菌的动作了, 09/12 00:26
23F：→ huhu126:如c大所言,直接抽反而更好,kit如果没强调一定要在低温或是 09/12 00:29
24F：→ huhu126:不要,那是否全程冰上应该没差,只有最後回溶离心後要低温, 09/12 00:30
25F：→ huhu126:另外,别兼实验室如果操作这只菌没问题,是否可以请老板让你 09/12 00:31
26F：→ huhu126:过去见习一下别人如何做?确实一破菌RNase就出来了,所以一 09/12 00:33
27F：→ huhu126:般可在此步骤加proteinase K.另外,我觉得破菌时间真的有点 09/12 00:35
28F：→ huhu126:久. 不过不太懂 RNA A及B差别为何? A明明有且纯?? 09/12 00:37
29F：推 huhu126:nanodrop可直接测出ng/ul,用1.5ul去测即可吧?7ul不心疼吗? 09/12 00:41
30F：推 yaliu:如果别间实验室用同样kit抽的出来，我觉得你还是去看一下他 09/12 00:47
31F：→ yaliu:们是如何操作的...不然我觉得传统trizol就很好抽了 09/12 00:48
32F：→ yaliu:步骤也没这麽多～但其实我们都会尽量全程冰上操作 09/12 00:49
33F：→ yaliu:然後我也觉得lysozyme处理有点久耶～这株菌这麽难破壁吗 09/12 00:51
34F：推 mattmatt:lysozyme真的处理有点久..破菌後RNase就放出来了 09/12 03:45
35F：→ mattmatt:RNA 15分钟就会被吃光.试试别的破菌法? 超音波.冷冻解冻. 09/12 03:46
36F：→ mattmatt:另外kit多少会有dna残留 原核的话还是dnase一下比较保险 09/12 03:50
37F：→ mattmatt:Dnase inactive建议用PCI/CI 65度C下Rnase活性会出来 09/12 03:52
38F：→ mattmatt:你说dnase完RT还会有band 这有点怪...dnase是哪一牌的阿? 09/12 03:57
39F：→ mattmatt:最後RT完没有band...这原因就很多了.. 09/12 03:58
40F：→ mattmatt:不知有没有RNA抽完直接跑胶的图可以看一下? 09/12 03:59
41F：→ sunday30430:见习这事我有跟老板说过，但没下文，我也很无法，至於 09/12 11:13
42F：→ sunday30430:7ul则因为我测三次啦!，老板说要三次平均! 09/12 11:13
43F：→ sunday30430:破菌的时间和方法是老板跟对面问的，对面做最好的一次 09/12 11:15
44F：→ sunday30430:是同样方法且时间更久! 09/12 11:16
45F：→ sunday30430:我不知道DNase是哪个牌子，我今天会去看一下! 09/12 11:23
46F：→ sunday30430:因为收菌前还有PRTREAT一些东西，但我下次会直接收完 09/12 11:32
47F：→ sunday30430:就抽! 09/12 11:32
48F：→ sunday30430:mattmatt:意思是我在DNasetreat时，会让rnase活化是吗 09/12 11:48
49F：推 mattmatt:一般用kit或传统方法甚至trizol纯化 多少会有rnase残留 09/12 19:22
50F：→ mattmatt:这应该大家都可认同,在dnase处理时会加rnase inhibitor 09/12 19:23
51F：→ mattmatt:这种情况在37度反应下 rnase活性似乎没有这麽高 09/12 19:24
52F：→ mattmatt:但在65度下 rnase活性似乎会很强 (不知道是哪只rnase) 09/12 19:24
53F：→ mattmatt:之前做测试 不管是否加入dnase或dnase inhibit solution 09/12 19:26
54F：→ mattmatt:RNA都会严重degrade 但手上没有"真正纯"的RNA 09/12 19:27
55F：→ mattmatt:所以很难证明究竟是RNase在65度下活性大增 09/12 19:27
56F：→ mattmatt:还是说RNA在65度下会degreade (已排除dnase或buffer污染) 09/12 19:28
57F：→ mattmatt:RT时也有一步将RNA加热至65度 姑且相信65度不会使RNA分解 09/12 19:30
58F：→ mattmatt:只能推测RNase於65度活性增强(印象有看过国外讨论有提到) 09/12 19:31
59F：推 mattmatt:最後还是用PCI/CI 管他有RNase DNase 一次清光光就没问题 09/12 19:34
60F：→ mattmatt:另外 从此之後抽RNA都没刻意放在冰上 一般室温操作都没事 09/12 19:34
61F：→ mattmatt:经过纯化後在室温下 RNase活性没有想像中的强 so... 09/12 19:37
62F：→ mattmatt:上面这句违反正道...为求保险 好孩子不要学XD 09/12 19:38
63F：推 yaliu:跟对面实验室打好关系～他们在抽的时候就过去看一下就好了XD 09/14 00:54
64F：→ left873:Staph破菌是关键 试试加完enzymes後37度C 15-20分钟再抽 09/15 09:15
65F：→ sunday30430:结果是KIT的问题，因为传统法有做出来! 09/17 09:07
66F：推 leoblack:要厂商退钱!!!! 09/17 12:09