作者sunday30430 (koalawoman)
看板Biotech
標題[求救] 抽RNA的器具要不要滅菌?
時間Fri Sep 10 19:19:49 2010
我上班兩個禮拜以來，一直都在做抽細菌的RNA和PCR，因為我對分生實驗室不了解，所以
當初拿到PROTOCOL時，以為是很成熟完整的實驗架構，可是我一直都做不出來老闆要的，
我去問了很多人才發現，我們的實驗架構很有問題，也才知道別人是怎麼做的，其中一點
是抽RNA的tip和eppendorf應該要拿去滅菌，尤其我是再開放式的空間抽RNA和PCR，我跟
老闆說，老闆說滅菌過後會更髒，因為水蒸氣會跑進去盒子裡，水有Rnase和DNase，我說
要噴酒精，老闆也說沒用。
我想請問滅菌真的沒有用嗎?
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◆ From: 163.25.118.160
1F：→ sunday30430:還有要怎麼說服老闆? 09/10 19:20
2F：推 leoblack:滅菌鍋用的水是Q水怎麼會有RNase?!你們是加自來水+口水 09/10 19:35
3F：推 datro:這樣 直接用DEPC H2O+ filter tip吧! 滅菌去不了RNase 09/10 19:58
4F：→ mzac1b:是用什麼方法抽? 我覺得方法也有差耶 09/10 20:19
5F：→ mzac1b:不滅菌是有些罕見 不會是買已經滅好的吧... 09/10 20:20
6F：→ sunday30430:老闆給我一個夾鏈單上面寫DNASE和RNASE free的器具， 09/10 20:44
7F：→ sunday30430:可是要自己裝進罐子和TIP盒子裡!這樣算是滅好的嗎??? 09/10 20:45
8F：→ sunday30430:是用geneaid的Total RNA Mini Kit 09/10 20:50
9F：→ sunday30430:我這週末會再做一次，因為之前連酵素在冰上，我都不知 09/10 21:04
10F：→ sunday30430:道，而且菌數也不對，滅菌的問題無法解決，也沒有 09/10 21:05
11F：→ sunday30430:FILTER 的 tip,另外，primer的溫度也不太對，如果最後 09/10 21:07
12F：→ sunday30430:改了還是做不出來，在跟老闆說要不要考慮去滅菌..... 09/10 21:08
13F：推 onlyone0419:買回來的tip跟eppendorf不都是RNAase free的嗎? 09/10 21:25
14F：→ onlyone0419:我以前隨便抽都可以抽的到，放心吧沒有那麼難抽啦~ 09/10 21:26
15F：推 f9361046:RNA很好抽 只要動作快習慣良好就好 09/10 21:33
16F：推 chougham:我們家是器具滅菌後~用180度烘箱烘Overnight再用~~ 09/10 21:37
17F：→ chougham:溶液都會用DEPC處理 09/10 21:38
18F：推 muchmoa:水蒸氣會把RNase帶進盒子裡嗎? 09/11 00:55
19F：推 ko363630:RNase不是酵素嗎? 那麼高的溫度不會死? 09/11 01:25
20F：推 chaunen:當在配製RNaseA溶液時 需經過"煮沸"這個步驟來殺死DNase 09/11 01:57
21F：→ chaunen:這樣夠耐命了吧XD 09/11 01:58
22F：→ chaunen:pipette拆開用3% H2O2擦過裡面, eppendorf tip用鑷子補 09/11 02:02
23F：→ chaunen:不需要滅菌 記得eppendorf tip整箱買來時 先拿幾包給RNA用 09/11 02:04
24F：→ chaunen:凡是拿取RNA用的東西, 最好使用乾淨手套 口罩 09/11 02:04
25F：→ chaunen:所有試劑都要RNase free 酒精 氯彷... 需另買RNA專用的 09/11 02:07
26F：→ chaunen:如果有個抽屜或櫃子專門放RNA use的東西最好！ 09/11 02:08
27F：→ chaunen:DEPC是劇毒, 使用請帶口罩 手套 1:1000溶於3次水 09/11 02:14
28F：→ chaunen:直接配在乾淨的血清瓶中, 在抽風櫃中用轉子攪拌overnight 09/11 02:16
29F：→ chaunen:隔天滅菌, 殺死DEPC（此時水呈現弱酸性 適合保存RNA） 09/11 02:17
30F：→ chaunen:瓶子跟轉子可以用1N鹽酸浸泡除去DNA, RNA滅過菌大概就掛了 09/11 02:20
31F：→ chaunen:操作時, 鋪抗污紙 手套 口罩必備, 最好別聊天 (切身之痛) 09/11 02:23
32F：→ chaunen:開放空間最好選擇沒人的角落 09/11 02:26
33F：→ chaunen:其實, 3% H2O2已經蠻威的了, 我刮棒都洗完泡20mins 擦乾 09/11 02:28
34F：→ chaunen:reuse一樣好端端的, 抽完的RNA保存在4度, 一週以內都還好 09/11 02:30
35F：→ chaunen:跑agarose gel還是好端端的2條band 09/11 02:31
36F：→ chaunen:抽細菌的話應該不能滅菌, 因為細菌的genome會炸出來的 09/11 02:32
37F：→ chaunen:細菌沒有intron 沒辦法跨, 可能更需要注重genomic DNA污染 09/11 02:34
38F：→ chaunen:抱歉 我還沒看完就推文... 沒看到你做的是細菌.... 09/11 02:35
39F：推 bider:剛買來的TIP的確不用滅菌 我們實驗室只有跟細胞培養有關的 09/11 05:26
40F：推 bider:才會進行滅菌 09/11 05:30
41F：推 bider:不如請s大把實驗流程跟大家說明一下吧 一起討論 09/11 05:36
42F：→ sunday30430:看到大家的意見真是太感人了，因為我是應屆畢業生，以 09/11 08:25
43F：→ sunday30430:前實驗室也不是做分生實驗，所以我在做的時候有好多個 09/11 08:26
44F：→ sunday30430:疑問，但因為老闆也不清楚，因為他也不是做這個，所以 09/11 08:27
45F：→ sunday30430:我也真的很無奈，我會先改些條件，週末結果會出來如果 09/11 08:28
46F：→ sunday30430:還是不行再來打整個流程，太謝謝大家了! 09/11 08:29
47F：推 allture:我們家抽RNA的eppendroff也沒滅菌 因為來的時候就是無菌狀 09/11 10:20
48F：→ allture:態 只要注意一下實驗周圍清潔 應該不需要太煩惱 09/11 10:21
49F：推 owl628:實驗室抽RNA的eppendroff跟tip也都是直接用沒有滅菌 09/11 17:31
50F：推 huhu126:不滅菌是可以的,但是要帶乾淨手套,以及不要邊抽邊交談, 09/12 00:11
51F：→ huhu126:geneaid的kit應該不會有問題,但buffer若要加酒精,請加100% 09/12 00:12
52F：→ huhu126:無水酒精而非工業用酒精,另外應該就是菌數要對且健康.... 09/12 00:14
53F：推 icome:RNase高溫會denature 但回到室溫又會renature 所以囉... 09/12 01:10
54F：→ sunday30430:居然要加無水酒精，老闆好像不是加這個耶! 09/12 11:18
55F：→ Lowrider:插ｔｉｐ跟裝小離心管的時候要店店 然後滅菌 醬就ｏｋ 09/12 16:15
56F：→ Lowrider:帶手套插 噴點酒精 09/12 16:15
57F：→ chaunen:無水酒精室溫下很快就變95%的囉~ 09/12 16:53
58F：→ sunday30430:所以加一般95%酒精有關係嗎? 09/12 19:02
59F：→ chaunen:我都用95%下去算... 抽DNA RNA OK 09/13 02:12
60F：→ chaunen:題外話, 抽nimi的 kit用工業酒精也沒啥問題= =" 09/13 02:13
61F：→ chaunen:(無水酒精好貴...ORZ) 09/13 02:13
62F：推 jimmyshen17:我們RNA USE的tip和eppendorf都會開新到的貨 09/14 13:34
63F：→ jimmyshen17:也就是封口袋只會打開一次 tip用鑷子插... 09/14 13:35
64F：→ jimmyshen17:其它物品只要有關抽RNA都是獨立一套 09/14 13:35
65F：→ jimmyshen17:當然滅菌會進行 只是注意從打開袋子的同時 09/14 13:36
66F：→ jimmyshen17:全程戴手套 戴口罩 09/14 13:37
67F：→ jimmyshen17:最後抽不抽的到就是運氣了.... 09/14 13:37
68F：→ jimmyshen17:在說你的RNA穩不穩定 那也是另一個問題y 09/14 13:38
69F：→ jimmyshen17:有人不戴口罩 邊講話邊抽 RNA也抽的到= = (無奈) 09/14 13:39
70F：推 lulusa:我以前做了兩年隨意抽白血球RNA的實驗 其實真的沒那麼難 09/15 20:16
71F：→ lulusa:只有TIP用filter的 其他的都沒有很特別準備酒精是100%+DEPC 09/15 20:17
72F：→ lulusa:每次抽出來的量都很穩定滿多的 就算以乾的RNA保存兩年 09/15 20:18
73F：→ lulusa:測出來的mRNA量也沒有少太多不過tip不要滅過我老闆也這樣說 09/15 20:19
74F：推 refulgence:之前跑RNA是把pipet拿去滅菌...還蠻有效的 09/20 17:58
75F：推 reinherd:我們實驗室用unfilter tip/買RNase free H2O來抽RNA 09/22 03:34
76F：→ Ice9:你 18S/28S rRNA 的品質呢？如果沒有 smear，那就不用擔心。 10/03 18:23