板上各位前輩好 小弟在IF上打轉了許久 但是苦苦找不出問題點... 我們家用的protocol如下: Animal: Rat(200-250g) Target: spinal 200 ml warm saline (全速infusion) ˇ 300-400 ml cool 4% formaldehyde( 一開始全速 過一半後降至 1 drop/sec) ˇ 取下要的段落 再切成約4-5mm長度 ˇ 泡至4% formaldehyde 4-5hr post-fixation ˇ 換成 30% sucrose solution dehydration (我知道有paper說用梯度脫水) ˇ 等sample 完全沉降後 取出放至平台切片機(非chamber式 是底座降溫) 加OCT做包埋 ˇ 切30um 替換式刀片 大概切2-3組換一片 水冷降溫器顯示為-17度 ˇ 以100 mM TBS 做wash 5 mins *6 ˇ 使用3% H2O2 處理 30min-1hr, RT ˇ wash 5 mins *6 unil the bubbles disappear ˇ Blocking 1 hr with 4% BSA+0.3% triton, RT ˇ wash 5 mins *2 ˇ Ab' in 1% BSA ,4度C O/N even to 72hr = =" ˇ wash 5 mins *6 ˇ Ab" in 1% BSA, RT 1hr ˇ wash 5mins *6 ˇ 以毛筆 在玻片上貼片 展片 P.S. 我是以free-floating的方式 從切片下來後的步驟 "wash,H2O2,block"皆於6孔盤2-3ml 接Ab都在24孔盤 200-300ul" 然後染出來的結果就會不對... 我要看的Lamina 1&2卻是暗的 偏偏我用的Ab'是 "PSD95" postsynaptic density 95 http://tinyurl.com/25zh2ao http://yfrog.com/mqimage7xj 老師跟學長說這東西在neuron上會很多 但是我在dorsal horn就染布出半個neuron的型態 我有懷疑過是染色有問題 但是很妙的是...marker的染色又幾乎沒什麼問題 部分receptor也可染到... GFAP http://tinyurl.com/2d3xyk7 http://yfrog.com/mvimage2zij OX-42 (小的貼片技術還不是很好 固有破損...) http://tinyurl.com/2bgkuzd NeuN http://tinyurl.com/2432eyk TNFR1: http://yfrog.com/j3image9bsj 然後最近更棘手...以前可以染到ventral horn的motor neuron 現在都消失了... motor neuron: http://tinyurl.com/2corwjq dorsal上的洞洞(不知道是neuron還是破洞了...): http://tinyurl.com/29c9275 螢光 http://tinyurl.com/2dmf9a7 一般光 從block濃度改變 Ab' Ab"的titer 接合時間 triton濃度 都試過了 而且我的background一直都很高1/200-2000 的差異 只有光度時間持續長短... 二抗是invitrogen的Alexa Fluor®555 & 488 donkey系列 濾鏡應該是可以濾出要的波長 最近我家老大 懷疑可能脫水不完全造成的破洞 所以小的又要開始著手試新條件 可是每天都在試條件 這樣下去實驗室會倒吧...救命喔!!! 等條件都抓到 我想別人碩士論文都寫完了!!! 拜託板上先進們 拉拔一下小弟吧 @@" 為了這個 我已經好久沒回家睡覺了 哭 每天都在實驗室住 在廁所洗澡ㄒ口ㄒ 拜託了!! 我已經很久不知道床是什麼東西了 請先進們指點一下吧!!!!! -- 如果能贏 誰想輸... 如果能成功 誰想失敗... 如果未來會更好 誰還會停滯不前... --

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