板上各位前辈好 小弟在IF上打转了许久 但是苦苦找不出问题点... 我们家用的protocol如下: Animal: Rat(200-250g) Target: spinal 200 ml warm saline (全速infusion) ˇ 300-400 ml cool 4% formaldehyde( 一开始全速 过一半後降至 1 drop/sec) ˇ 取下要的段落 再切成约4-5mm长度 ˇ 泡至4% formaldehyde 4-5hr post-fixation ˇ 换成 30% sucrose solution dehydration (我知道有paper说用梯度脱水) ˇ 等sample 完全沉降後 取出放至平台切片机(非chamber式 是底座降温) 加OCT做包埋 ˇ 切30um 替换式刀片 大概切2-3组换一片 水冷降温器显示为-17度 ˇ 以100 mM TBS 做wash 5 mins *6 ˇ 使用3% H2O2 处理 30min-1hr, RT ˇ wash 5 mins *6 unil the bubbles disappear ˇ Blocking 1 hr with 4% BSA+0.3% triton, RT ˇ wash 5 mins *2 ˇ Ab' in 1% BSA ,4度C O/N even to 72hr = =" ˇ wash 5 mins *6 ˇ Ab" in 1% BSA, RT 1hr ˇ wash 5mins *6 ˇ 以毛笔 在玻片上贴片 展片 P.S. 我是以free-floating的方式 从切片下来後的步骤 "wash,H2O2,block"皆於6孔盘2-3ml 接Ab都在24孔盘 200-300ul" 然後染出来的结果就会不对... 我要看的Lamina 1&2却是暗的 偏偏我用的Ab'是 "PSD95" postsynaptic density 95 http://tinyurl.com/25zh2ao http://yfrog.com/mqimage7xj 老师跟学长说这东西在neuron上会很多 但是我在dorsal horn就染布出半个neuron的型态 我有怀疑过是染色有问题 但是很妙的是...marker的染色又几乎没什麽问题 部分receptor也可染到... GFAP http://tinyurl.com/2d3xyk7 http://yfrog.com/mvimage2zij OX-42 (小的贴片技术还不是很好 固有破损...) http://tinyurl.com/2bgkuzd NeuN http://tinyurl.com/2432eyk TNFR1: http://yfrog.com/j3image9bsj 然後最近更棘手...以前可以染到ventral horn的motor neuron 现在都消失了... motor neuron: http://tinyurl.com/2corwjq dorsal上的洞洞(不知道是neuron还是破洞了...): http://tinyurl.com/29c9275 萤光 http://tinyurl.com/2dmf9a7 一般光 从block浓度改变 Ab' Ab"的titer 接合时间 triton浓度 都试过了 而且我的background一直都很高1/200-2000 的差异 只有光度时间持续长短... 二抗是invitrogen的Alexa Fluor®555 & 488 donkey系列 滤镜应该是可以滤出要的波长 最近我家老大 怀疑可能脱水不完全造成的破洞 所以小的又要开始着手试新条件 可是每天都在试条件 这样下去实验室会倒吧...救命喔!!! 等条件都抓到 我想别人硕士论文都写完了!!! 拜托板上先进们 拉拔一下小弟吧 @@" 为了这个 我已经好久没回家睡觉了 哭 每天都在实验室住 在厕所洗澡ㄒ口ㄒ 拜托了!! 我已经很久不知道床是什麽东西了 请先进们指点一下吧!!!!! -- 如果能赢 谁想输... 如果能成功 谁想失败... 如果未来会更好 谁还会停滞不前... --

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