作者eatofy (平常心)
看板Biotech
標題[問題] western blot band不均勻
時間Sun Sep 5 23:07:36 2010
※ [本文轉錄自 Biology 看板 #1CVvTXcN ]
作者: eatofy (平常心) 看板: Biology
標題: [問題] western blot band不均勻
時間: Thu Sep 2 20:23:58 2010
【問題】：western blot 再running時，靠近marker的well都會斜一邊。
壓完片後，每個well的band不均勻
我是用0.75的膠 runnung 100v 1hr
transfer 400A 1.5hr
全程on ice
【問題起因】：一開始以為是蛋白質定量的問題，一直再練習
現在定量都控制R^2 0.99。也有請學長幫我，照我定量
出來的配方，配sample。
但是，同一片膠，有我自己配的sample與學長配的sample
跑出來的band全部都不均勻，影像分析的結果當然是差異很大
(練習跑b actin)
【個人看法】：不太曉得是甚麼原因= =a 定量方面的R^2因該是沒問題
難道會是在loading 到well時出錯?
sample我是跑膠前天準備好，冰再-20，
跑膠前退冰、votex直接loading <===會是這問題嗎?
麻煩大家幫我解決? 謝謝
這是我壓出來的圖
http://0rz.tw/naJ50
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◆ From: 120.126.71.89
1F：推 aeroufo:你做膠會不會有問題呀?? 09/02 23:50
2F：→ chungwt:會不會你在洗抗體的時候 是直接從中間出下去? 09/03 00:39
3F：→ chungwt:這樣還滿容易把抗體沖起來的耶!? 09/03 00:40
4F：→ genep:有圖嗎? 09/03 01:04
※ 編輯: eatofy 來自: 120.126.71.89 (09/05 23:03)
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◆ From: 120.126.71.89
5F：推 kiko114:似乎是抗體不均勻的問題 試著多加抗體量或提高濃度試試 09/05 23:30
6F：→ kiko114:洗的時候也不要從membrane上直接倒 09/05 23:31
7F：→ kiko114:膠也凝的不太好就是了 不過sample處理應該沒問題 09/05 23:32
8F：→ eatofy:謝謝 我會再試試看 09/05 23:33
9F：推 aeroufo:你跑膠的溫度問題啦，你看你的膠往兩邊彎，你把他拿到Cold 09/05 23:48
10F：→ aeroufo:ROOM裡面跑一次看看應該就沒問題了 09/05 23:48
11F：→ aeroufo:ㄝ我搞錯了應該是做膠的問題吧 09/05 23:50
12F：→ genep:如果membrane沒有放反的話,確認一下抗體夠不夠及buffer有沒 09/06 00:35
13F：→ genep:有細菌汙染(buffer都重泡試看看). 09/06 00:36
14F：推 icome:之前我拿認denature的抗體去認nondenature的sample也會這樣 09/06 09:34
15F：推 celestial318:用現做的膠試試? 我們做膠頂多放4度C 不會放-20 09/06 14:07
16F：→ iceking:樓上,他是把sample放-20,不是膠啦~ 09/06 16:39
17F：→ celestial318:對 我眼殘= = 那應該denature不均勻 09/07 16:48
18F：→ pomelogirl:會不會是ECL呈色太強燒掉阿 不然就是抗體包不均勻餒 09/24 18:25