作者eatofy (平常心)
看板Biotech
标题[问题] western blot band不均匀
时间Sun Sep 5 23:07:36 2010
※ [本文转录自 Biology 看板 #1CVvTXcN ]
作者: eatofy (平常心) 看板: Biology
标题: [问题] western blot band不均匀
时间: Thu Sep 2 20:23:58 2010
【问题】：western blot 再running时，靠近marker的well都会斜一边。
压完片後，每个well的band不均匀
我是用0.75的胶 runnung 100v 1hr
transfer 400A 1.5hr
全程on ice
【问题起因】：一开始以为是蛋白质定量的问题，一直再练习
现在定量都控制R^2 0.99。也有请学长帮我，照我定量
出来的配方，配sample。
但是，同一片胶，有我自己配的sample与学长配的sample
跑出来的band全部都不均匀，影像分析的结果当然是差异很大
(练习跑b actin)
【个人看法】：不太晓得是甚麽原因= =a 定量方面的R^2因该是没问题
难道会是在loading 到well时出错?
sample我是跑胶前天准备好，冰再-20，
跑胶前退冰、votex直接loading <===会是这问题吗?
麻烦大家帮我解决? 谢谢
这是我压出来的图
http://0rz.tw/naJ50
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◆ From: 120.126.71.89
1F：推 aeroufo:你做胶会不会有问题呀?? 09/02 23:50
2F：→ chungwt:会不会你在洗抗体的时候 是直接从中间出下去? 09/03 00:39
3F：→ chungwt:这样还满容易把抗体冲起来的耶!? 09/03 00:40
4F：→ genep:有图吗? 09/03 01:04
※ 编辑: eatofy 来自: 120.126.71.89 (09/05 23:03)
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◆ From: 120.126.71.89
5F：推 kiko114:似乎是抗体不均匀的问题 试着多加抗体量或提高浓度试试 09/05 23:30
6F：→ kiko114:洗的时候也不要从membrane上直接倒 09/05 23:31
7F：→ kiko114:胶也凝的不太好就是了 不过sample处理应该没问题 09/05 23:32
8F：→ eatofy:谢谢 我会再试试看 09/05 23:33
9F：推 aeroufo:你跑胶的温度问题啦，你看你的胶往两边弯，你把他拿到Cold 09/05 23:48
10F：→ aeroufo:ROOM里面跑一次看看应该就没问题了 09/05 23:48
11F：→ aeroufo:ㄝ我搞错了应该是做胶的问题吧 09/05 23:50
12F：→ genep:如果membrane没有放反的话,确认一下抗体够不够及buffer有没 09/06 00:35
13F：→ genep:有细菌污染(buffer都重泡试看看). 09/06 00:36
14F：推 icome:之前我拿认denature的抗体去认nondenature的sample也会这样 09/06 09:34
15F：推 celestial318:用现做的胶试试? 我们做胶顶多放4度C 不会放-20 09/06 14:07
16F：→ iceking:楼上,他是把sample放-20,不是胶啦~ 09/06 16:39
17F：→ celestial318:对 我眼残= = 那应该denature不均匀 09/07 16:48
18F：→ pomelogirl:会不会是ECL呈色太强烧掉阿 不然就是抗体包不均匀馁 09/24 18:25