作者bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)
看板Biotech
標題Re: [求救] 如何使用chitin bead 純化?
時間Tue Aug 31 07:54:06 2010
※ 引述《jj5110 (大同牌電子鍋)》之銘言：
: 我需要做出一張SDS－PAGE的圖片，上面必須出現S.IS.DTT.及CBD加熱
: 如果利用Chitin bead純化，要怎麼做出?(我需要方法及步驟)
看你想load的順序應該是 可溶 不可溶 DTT treat後 跟直接煮bead
一般intein-CBD純化方式就是 先破菌 高速離心 通cloumn(bead)
然後用high salt去洗(有時候會帶一點detergent 可參考NEB官方)
之後最後一次 是做 in cloumn digest
就是把通過protein 洗掉non specific binding後的beads
泡在含高濃度DTT(我是用30mM)的buffer中
然後放4度讓他切o/n(至少12~16hr 個人經驗切久一點會好一點不過看你蛋白穩定度)
之後再elute 就是你要的DTT那一個well
可溶 不可溶就是高速離心後的上清液跟沉澱處
是說你怎麼沒load一個Cell lysate
看起來好像你連是否能induce你的protein都不確定(我猜你這就是順便做這測試)
所以我覺得你通beads後可以根本不洗 直接換DTT去泡者
不過還是建議讓beads跟supernatant混久一點
(2hr以上 但是也不要太久)
你可以參考NEB的說明 跟一些已發表的paper中有使用你這vector純化的步驟
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