作者bluecsky (我要蓝蓝淡淡的天空)
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标题Re: [求救] 如何使用chitin bead 纯化?
时间Tue Aug 31 07:54:06 2010
※ 引述《jj5110 (大同牌电子锅)》之铭言：
: 我需要做出一张SDS－PAGE的图片，上面必须出现S.IS.DTT.及CBD加热
: 如果利用Chitin bead纯化，要怎麽做出?(我需要方法及步骤)
看你想load的顺序应该是 可溶 不可溶 DTT treat後 跟直接煮bead
一般intein-CBD纯化方式就是 先破菌 高速离心 通cloumn(bead)
然後用high salt去洗(有时候会带一点detergent 可参考NEB官方)
之後最後一次 是做 in cloumn digest
就是把通过protein 洗掉non specific binding後的beads
泡在含高浓度DTT(我是用30mM)的buffer中
然後放4度让他切o/n(至少12~16hr 个人经验切久一点会好一点不过看你蛋白稳定度)
之後再elute 就是你要的DTT那一个well
可溶 不可溶就是高速离心後的上清液跟沉淀处
是说你怎麽没load一个Cell lysate
看起来好像你连是否能induce你的protein都不确定(我猜你这就是顺便做这测试)
所以我觉得你通beads後可以根本不洗 直接换DTT去泡者
不过还是建议让beads跟supernatant混久一点
(2hr以上 但是也不要太久)
你可以参考NEB的说明 跟一些已发表的paper中有使用你这vector纯化的步骤
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