作者jj5110 (大同牌電子鍋)
看板Biotech
標題[求救] 如何使用chitin bead 純化?
時間Mon Aug 30 16:36:32 2010
我需要做出一張SDS－PAGE的圖片，上面必須出現S.IS.DTT.及CBD加熱
如果利用Chitin bead純化，要怎麼做出?(我需要方法及步驟)
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◆ From: 210.240.242.197
1F：推 bluecsky:你用哪一種intein? 08/30 19:16
2F：→ bluecsky:方法與步驟 一般純化沒有絕對的標準程序 都要看你case 08/30 19:16
3F：→ bluecsky:當然也不能說沒有一個標準做法 你可以參考做過的paper 08/30 19:17
4F：→ bluecsky:或是官方的一些條件 然後自己修改來配合你的東西 08/30 19:17
5F：→ bluecsky:因為你說的不清不楚 連表現的host 使用的tag都沒講清楚 08/30 19:18
6F：→ bluecsky:目標蛋白多大? 你做過可溶性測試沒有? 08/30 19:18
7F：→ bluecsky:CBD tag一般前面都接了intein 之後elute是靠intein自切 08/30 19:19
8F：→ bluecsky:來做elute 但是intein很多種 你是用哪一種? 08/30 19:19
9F：→ milkpa:上面都寫了「加熱」，就下去煮吧，不過活性大概也沒了 08/30 21:41
10F：推 bluecsky:我不太懂的另一點就是加熱要幹嘛 一般DTT可以誘導intein 08/30 21:46
11F：→ bluecsky:的自切反應 然後反應完後就是elute拿到要的蛋白 08/30 21:46
12F：→ bluecsky:之後就用酸 鹼把beads洗一洗就可以再reuse 加熱是..? 08/30 21:47
13F：→ bluecsky:閒蛋白太強了要給他一點挑戰嗎? 08/30 21:47
14F：推 milkpa:加熱就是把bead上面的蛋白質洗下來，完全不管活性 08/30 23:09
15F：→ milkpa:根據原發問者，就只是要這樣而已 08/30 23:09
16F：→ milkpa:另外，如果以原發問者所希望的lane的順序，事實上加熱的 08/30 23:11
17F：→ milkpa:那一組，會呈現的是未切乾淨的融合蛋白＋ChBD-intein兩片段 08/30 23:13
18F：推 bluecsky:那加熱後beads不就報銷了? 08/31 00:36
19F：→ jj5110:應該是說...我的質體上有一段pTWIN 08/31 00:43
20F：→ jj5110:要做chitin-binding doman 08/31 00:44
21F：→ jj5110:如果要用chitin bead 純化的話那，DTT的片段要如何表現出來 08/31 00:44
22F：→ jj5110:我要"實驗方法"，因為加熱後我要表現的是我CBD有專一性的 08/31 00:45
23F：→ jj5110:效果，但是DTT的部分要怎麼加入? 08/31 00:46