作者jj5110 (大同牌电子锅)
看板Biotech
标题[求救] 如何使用chitin bead 纯化?
时间Mon Aug 30 16:36:32 2010
我需要做出一张SDS－PAGE的图片，上面必须出现S.IS.DTT.及CBD加热
如果利用Chitin bead纯化，要怎麽做出?(我需要方法及步骤)
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◆ From: 210.240.242.197
1F：推 bluecsky:你用哪一种intein? 08/30 19:16
2F：→ bluecsky:方法与步骤 一般纯化没有绝对的标准程序 都要看你case 08/30 19:16
3F：→ bluecsky:当然也不能说没有一个标准做法 你可以参考做过的paper 08/30 19:17
4F：→ bluecsky:或是官方的一些条件 然後自己修改来配合你的东西 08/30 19:17
5F：→ bluecsky:因为你说的不清不楚 连表现的host 使用的tag都没讲清楚 08/30 19:18
6F：→ bluecsky:目标蛋白多大? 你做过可溶性测试没有? 08/30 19:18
7F：→ bluecsky:CBD tag一般前面都接了intein 之後elute是靠intein自切 08/30 19:19
8F：→ bluecsky:来做elute 但是intein很多种 你是用哪一种? 08/30 19:19
9F：→ milkpa:上面都写了「加热」，就下去煮吧，不过活性大概也没了 08/30 21:41
10F：推 bluecsky:我不太懂的另一点就是加热要干嘛 一般DTT可以诱导intein 08/30 21:46
11F：→ bluecsky:的自切反应 然後反应完後就是elute拿到要的蛋白 08/30 21:46
12F：→ bluecsky:之後就用酸 硷把beads洗一洗就可以再reuse 加热是..? 08/30 21:47
13F：→ bluecsky:闲蛋白太强了要给他一点挑战吗? 08/30 21:47
14F：推 milkpa:加热就是把bead上面的蛋白质洗下来，完全不管活性 08/30 23:09
15F：→ milkpa:根据原发问者，就只是要这样而已 08/30 23:09
16F：→ milkpa:另外，如果以原发问者所希望的lane的顺序，事实上加热的 08/30 23:11
17F：→ milkpa:那一组，会呈现的是未切乾净的融合蛋白＋ChBD-intein两片段 08/30 23:13
18F：推 bluecsky:那加热後beads不就报销了? 08/31 00:36
19F：→ jj5110:应该是说...我的质体上有一段pTWIN 08/31 00:43
20F：→ jj5110:要做chitin-binding doman 08/31 00:44
21F：→ jj5110:如果要用chitin bead 纯化的话那，DTT的片段要如何表现出来 08/31 00:44
22F：→ jj5110:我要"实验方法"，因为加热後我要表现的是我CBD有专一性的 08/31 00:45
23F：→ jj5110:效果，但是DTT的部分要怎麽加入? 08/31 00:46