作者nurXiah ()
看板Biotech
標題限制酶切不好......
時間Wed Aug 25 22:06:02 2010
最近要把insert換到另一個載體(8kbp)
insert的部分用相同的限制酶已經切好了 跑膠check size也是對的
但用同樣的限制酶去切載體(transform到細菌內大量複製,再抽完plasmid)卻一直切不好
兩種限制酶試過作用37度 3h,4h,5h 但要切膠回收時跑出來的band都怪怪的
有位置明顯不對的 有跑出好幾條band的(照理說應該是兩條) 也有band上方有拖拖的痕跡
切完膠用kit回收 再跑膠check 出來的都是兩條band(照理來講回收完應該只有一條)
限制酶各取1ul 也有用指定的buffer plasmid取30ul/100ul和50ul/60ul
可是目前做了6,7次 還是做不出來XD
為了怕有離子干擾 elute都是用滅菌過的二次水
但爬文後 發現很多人有做純化的動作 實驗室是沒有這樣做 不知道純化的必要性大不大
麻煩經驗豐富的版友給個建議 前面做不出來 後面ligation也不用做了XD
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 218.162.73.171
1F：→ bloodelf:check the enzyme sites on the plasmid. 08/25 22:12
2F：→ bloodelf:sounds that the site you use are not unique. 08/25 22:12
3F：→ nurXiah:我看了一下map,這兩種酵素都只有一個切位,所以可以排除這 08/25 22:50
4F：→ nurXiah:個可能性? 08/25 22:50
5F：→ bloodelf:Try cutting the plasmid with the enzymes separately? 08/25 23:15
6F：→ bloodelf:sometimes even though the sites are there, 08/25 23:16
7F：→ bloodelf:sitll might not cut properly. Good luck! 08/25 23:17
8F：→ nurXiah:謝謝~我試試看,希望能成功! 08/25 23:35
9F：→ chaunen:如果是一團一團拖尾的 應該是plasmid太多了, 正常 08/28 00:40
10F：→ chaunen:plasmid最好先定量, 用2X酵素+2X時間作用 08/28 00:42
11F：→ chaunen:例如: NEB 的 EcoR1是20,000U/ml 表示1ul裡有20U 08/28 00:43
12F：→ chaunen:也就是說1ul的EcoR1可以在1hr內切完20ug的plasmid(理論啦) 08/28 00:44
13F：推 chaunen:而total體積是50ul 08/28 00:46
14F：→ chaunen:注意甘油最好小於總體積5%避免影響酵素作用 08/28 00:48
15F：→ chaunen:切太久也是沒必要的, 切太久則會有亂切的可能 08/28 00:49
16F：→ chaunen:如果兩個RE site靠太近(相差幾個mer而以),則會切不好 08/28 00:50
17F：→ chaunen:酵素要binding上去也是要占掉RE site旁一些空間的 08/28 00:51
18F：→ chaunen:對了, 有些酵素需要BSA 記得加 08/28 00:52
19F：→ chaunen:切出來size不對的就別管他了(雜菌吧= =") 08/28 00:55
20F：→ chaunen:2條band的要看size, 沒被切的supercoil form 會跑比較快 08/28 00:57
21F：→ chaunen:水滅菌跟離子干擾好像沒關係XD: 08/28 00:59
22F：→ nurXiah:請問要怎麼計算甘油小於總體積5% ? 為什麼甘油會干擾? 08/29 00:09
24F：→ chaunen:NEB的RE enzyme 保存在50% glycerol中, 一般而言, 08/29 19:07
25F：→ chaunen:10ul的反應體積最好只加入1ul enzyme, 08/29 19:07