作者nurXiah ()
看板Biotech
标题限制酶切不好......
时间Wed Aug 25 22:06:02 2010
最近要把insert换到另一个载体(8kbp)
insert的部分用相同的限制酶已经切好了 跑胶check size也是对的
但用同样的限制酶去切载体(transform到细菌内大量复制,再抽完plasmid)却一直切不好
两种限制酶试过作用37度 3h,4h,5h 但要切胶回收时跑出来的band都怪怪的
有位置明显不对的 有跑出好几条band的(照理说应该是两条) 也有band上方有拖拖的痕迹
切完胶用kit回收 再跑胶check 出来的都是两条band(照理来讲回收完应该只有一条)
限制酶各取1ul 也有用指定的buffer plasmid取30ul/100ul和50ul/60ul
可是目前做了6,7次 还是做不出来XD
为了怕有离子干扰 elute都是用灭菌过的二次水
但爬文後 发现很多人有做纯化的动作 实验室是没有这样做 不知道纯化的必要性大不大
麻烦经验丰富的版友给个建议 前面做不出来 後面ligation也不用做了XD
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 218.162.73.171
1F：→ bloodelf:check the enzyme sites on the plasmid. 08/25 22:12
2F：→ bloodelf:sounds that the site you use are not unique. 08/25 22:12
3F：→ nurXiah:我看了一下map,这两种酵素都只有一个切位,所以可以排除这 08/25 22:50
4F：→ nurXiah:个可能性? 08/25 22:50
5F：→ bloodelf:Try cutting the plasmid with the enzymes separately? 08/25 23:15
6F：→ bloodelf:sometimes even though the sites are there, 08/25 23:16
7F：→ bloodelf:sitll might not cut properly. Good luck! 08/25 23:17
8F：→ nurXiah:谢谢~我试试看,希望能成功! 08/25 23:35
9F：→ chaunen:如果是一团一团拖尾的 应该是plasmid太多了, 正常 08/28 00:40
10F：→ chaunen:plasmid最好先定量, 用2X酵素+2X时间作用 08/28 00:42
11F：→ chaunen:例如: NEB 的 EcoR1是20,000U/ml 表示1ul里有20U 08/28 00:43
12F：→ chaunen:也就是说1ul的EcoR1可以在1hr内切完20ug的plasmid(理论啦) 08/28 00:44
13F：推 chaunen:而total体积是50ul 08/28 00:46
14F：→ chaunen:注意甘油最好小於总体积5%避免影响酵素作用 08/28 00:48
15F：→ chaunen:切太久也是没必要的, 切太久则会有乱切的可能 08/28 00:49
16F：→ chaunen:如果两个RE site靠太近(相差几个mer而以),则会切不好 08/28 00:50
17F：→ chaunen:酵素要binding上去也是要占掉RE site旁一些空间的 08/28 00:51
18F：→ chaunen:对了, 有些酵素需要BSA 记得加 08/28 00:52
19F：→ chaunen:切出来size不对的就别管他了(杂菌吧= =") 08/28 00:55
20F：→ chaunen:2条band的要看size, 没被切的supercoil form 会跑比较快 08/28 00:57
21F：→ chaunen:水灭菌跟离子干扰好像没关系XD: 08/28 00:59
22F：→ nurXiah:请问要怎麽计算甘油小於总体积5% ? 为什麽甘油会干扰? 08/29 00:09
24F：→ chaunen:NEB的RE enzyme 保存在50% glycerol中, 一般而言, 08/29 19:07
25F：→ chaunen:10ul的反应体积最好只加入1ul enzyme, 08/29 19:07