作者keeny (keeny NN )
看板Biotech
標題[求救] Methylation Specific PCR
時間Sun Aug 22 13:48:18 2010
各位板上的先進
我已經在Methylation Specific PCR(MSP)掙扎很久
而且實驗室的老闆似乎已經很不耐心的催討DATA
我已經嚐試使用不同的annealing temp 並且加入5%DMSO
但是依然沒有任何PCR產物, 除了每次固定的primer dimmer.
懇請有經驗的各位幫我看看並且給我一些寶貴建議 謝謝!
我使用Qiagen DNAeasy extract human melanoma cell genomic DNA
Bisulfite conversion 是用Zymo research DNA methylation Gold kit
把1ug GDNA製備成BS DNA供MSP使用.
我想要了解tumor suppressor promoter sequence(322bp), GC rich(60%),
是否有methylation 而導致cancer metastasis.
以下是我的50ul MSP condition
BS DNA 50ng
PCR kit Roche Gold taq
new dNTP
95C 2min
-------------------
以下35-45cycle(我35和45都試過,一樣失敗)
95C 30sec
51-59C 30sec
72C 1min
--------------------
最後
72C 5min
4C Infinity
請問是我的taq polymerase不好嗎?
Primer是paper上的 我也有另外設計其他primer(全部失敗)
請問除了primer外 哪裡有可能出錯呢?
謝謝指教
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oh my god!! 我又在枕頭上流口水啦！！
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 98.235.141.212
1F：→ sancra:primer dimer的話，提高你的template濃度看看 08/22 21:54
2F：→ sancra:另外你的primer濃度是多少?? 08/22 21:54
3F：→ sancra:再來95度denature和annealing時間可提高到一分鐘 08/22 21:55
4F：→ sancra:再不來還有一個可能，你的bisulfite conversion沒轉好 08/22 21:56
5F：→ sancra:你的PCR有沒有做positive control?? 08/22 21:56
6F：→ keeny:謝謝你的建議, primer final conc.=0.4uM, 有做+control 08/23 12:08