作者keeny (keeny NN )
看板Biotech
标题[求救] Methylation Specific PCR
时间Sun Aug 22 13:48:18 2010
各位板上的先进
我已经在Methylation Specific PCR(MSP)挣扎很久
而且实验室的老板似乎已经很不耐心的催讨DATA
我已经嚐试使用不同的annealing temp 并且加入5%DMSO
但是依然没有任何PCR产物, 除了每次固定的primer dimmer.
恳请有经验的各位帮我看看并且给我一些宝贵建议 谢谢!
我使用Qiagen DNAeasy extract human melanoma cell genomic DNA
Bisulfite conversion 是用Zymo research DNA methylation Gold kit
把1ug GDNA制备成BS DNA供MSP使用.
我想要了解tumor suppressor promoter sequence(322bp), GC rich(60%),
是否有methylation 而导致cancer metastasis.
以下是我的50ul MSP condition
BS DNA 50ng
PCR kit Roche Gold taq
new dNTP
95C 2min
-------------------
以下35-45cycle(我35和45都试过,一样失败)
95C 30sec
51-59C 30sec
72C 1min
--------------------
最後
72C 5min
4C Infinity
请问是我的taq polymerase不好吗?
Primer是paper上的 我也有另外设计其他primer(全部失败)
请问除了primer外 哪里有可能出错呢?
谢谢指教
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oh my god!! 我又在枕头上流口水啦！！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 98.235.141.212
1F：→ sancra:primer dimer的话，提高你的template浓度看看 08/22 21:54
2F：→ sancra:另外你的primer浓度是多少?? 08/22 21:54
3F：→ sancra:再来95度denature和annealing时间可提高到一分钟 08/22 21:55
4F：→ sancra:再不来还有一个可能，你的bisulfite conversion没转好 08/22 21:56
5F：→ sancra:你的PCR有没有做positive control?? 08/22 21:56
6F：→ keeny:谢谢你的建议, primer final conc.=0.4uM, 有做+control 08/23 12:08