作者blueashin (tRoMboNe pLaYer)
看板Biotech
標題[求救] DNA基因片段pcr無法擴增
時間Fri Aug 20 00:15:33 2010
各位好
我想要求救的問題是:
我進行一段DNA片段的PCR擴增
已經試了一段時間了 完全沒有辦法擴增出來
但是我對該基因進行 RT-PCR 擴增是沒有問題的
以相同的primer進行DNA的擴增卻無法擴增
更奇怪的是
我把該DNA片段 拆成兩段作PCR卻可以做出來
例如 該片段總長度為2000 bp
由1-1500 可以做出來 由1400-2000可以做出來
可是做1-2000卻不行
真的很奇怪
不知道各位先進有沒有什麼看法
請大家指教
我的pcr條件:
94 C 5 min
94 C 1.5 min }
60 C 1 min }
72 C 2.5 min } 40cycle
72 C 5 min
基本上以2k 的長度應該一定要可以才對
但是做不出來
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 111.242.135.19
1F：→ blueashin:忘記說 我用的酵素是 C牌的 advantage 2 08/20 00:17
2F：推 aeroufo:妳可以把1.5 mins 調成 2.0 mins 08/20 00:34
3F：→ aeroufo:再者，妳跑那麼多cycle幹嘛??30就夠了啦 08/20 00:35
4F：→ aeroufo:不信妳可以去測，妳跑高於30妳的PCR產物也不會高到哪去 08/20 00:35
5F：→ blueashin:= ="因為怕放不出來...才會做這麼多cycle 08/20 00:35
6F：→ aeroufo:因為酵素沒法這麼耐，除非妳跑到一半加酵素 08/20 00:36
7F：→ blueashin:恩恩 謝謝你的意見 我會試試看~^^ 08/20 00:38
8F：→ singren:會不會兩各primer的Tm值差太多.. 08/20 09:59
9F：→ Ianthegood:既然分成兩段做得出來就分開跑好再混在一起吧XD(誤) 08/20 18:20
10F：→ Ianthegood:混起來再跑一次全長? 08/20 18:21
11F：→ blueashin:如果分開放 我想必須要先用限制酶切過 再做ligation 08/22 01:57
12F：→ blueashin:才能再放全長 這個部分我做過 之前沒成功 08/22 01:57
13F：→ blueashin:但理論上DNA一定要放得出來才對... 08/22 01:58
14F：推 Fourfish:請教一下 你有沒有考慮到intron的問題？確定一下primer是 08/25 12:29
15F：→ Fourfish:不是跨exons 另外94度降到30s就夠了 煮太久對酵素也不好 08/25 12:30