作者blueashin (tRoMboNe pLaYer)
看板Biotech
标题[求救] DNA基因片段pcr无法扩增
时间Fri Aug 20 00:15:33 2010
各位好
我想要求救的问题是:
我进行一段DNA片段的PCR扩增
已经试了一段时间了 完全没有办法扩增出来
但是我对该基因进行 RT-PCR 扩增是没有问题的
以相同的primer进行DNA的扩增却无法扩增
更奇怪的是
我把该DNA片段 拆成两段作PCR却可以做出来
例如 该片段总长度为2000 bp
由1-1500 可以做出来 由1400-2000可以做出来
可是做1-2000却不行
真的很奇怪
不知道各位先进有没有什麽看法
请大家指教
我的pcr条件:
94 C 5 min
94 C 1.5 min }
60 C 1 min }
72 C 2.5 min } 40cycle
72 C 5 min
基本上以2k 的长度应该一定要可以才对
但是做不出来
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 111.242.135.19
1F：→ blueashin:忘记说 我用的酵素是 C牌的 advantage 2 08/20 00:17
2F：推 aeroufo:你可以把1.5 mins 调成 2.0 mins 08/20 00:34
3F：→ aeroufo:再者，你跑那麽多cycle干嘛??30就够了啦 08/20 00:35
4F：→ aeroufo:不信你可以去测，你跑高於30你的PCR产物也不会高到哪去 08/20 00:35
5F：→ blueashin:= ="因为怕放不出来...才会做这麽多cycle 08/20 00:35
6F：→ aeroufo:因为酵素没法这麽耐，除非你跑到一半加酵素 08/20 00:36
7F：→ blueashin:恩恩 谢谢你的意见 我会试试看~^^ 08/20 00:38
8F：→ singren:会不会两各primer的Tm值差太多.. 08/20 09:59
9F：→ Ianthegood:既然分成两段做得出来就分开跑好再混在一起吧XD(误) 08/20 18:20
10F：→ Ianthegood:混起来再跑一次全长? 08/20 18:21
11F：→ blueashin:如果分开放 我想必须要先用限制酶切过 再做ligation 08/22 01:57
12F：→ blueashin:才能再放全长 这个部分我做过 之前没成功 08/22 01:57
13F：→ blueashin:但理论上DNA一定要放得出来才对... 08/22 01:58
14F：推 Fourfish:请教一下 你有没有考虑到intron的问题？确定一下primer是 08/25 12:29
15F：→ Fourfish:不是跨exons 另外94度降到30s就够了 煮太久对酵素也不好 08/25 12:30